蛋白质组学整理——2014(修改版).doc

第1章 绪论 (名词解释8个5分 简答3个十分 论述2个15分)名词解释：1. 蛋白质组：指的是由一个细胞、一个组织或是一种生物的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个整体概念。2. 蛋白质组学：旨在阐明生物体内全部蛋白质的表达模式和功能模式，其内容包括蛋白质的表达与存在方式（修饰方式），结构与功能，以及各个蛋白质之间相互作用等。3. 可变剪接：是指同一基因转录形成的RNA前体可经过一种以上剪接方式产生多种不同的mRNA的过程。可将同一基因中的外显子以不同的组合方式来表现，使一个基因在不同时间、不同环境中能够制造出不同的蛋白质。从而使蛋白质组的复杂性远远高于基因组。4. 蛋白质翻译后修饰（PTM）：是指对新合成的多肽链或蛋白质进行的化学修饰，主要是磷酸化、糖基化、酰基化、硝基化、磺基化、脂化、泛素化和水解修饰等。使数量有限的编码基因产生数量巨大的蛋白质。简答题：1. 基因组与蛋白组的区别与联系（1） 同一性与多样性：同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的；对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下，蛋白质组的构成是不同的（2） 有限性与无限性：基因组无论大小，其核苷酸的数量和序列是一定的，对基因组序列的测定是一种“有限”的工作；由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很难确定蛋白质组的蛋白质数量；对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。（3） 静态与动态：一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变；个体的蛋白质组，作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中却总是变动的。（4） 周期性与空间性：基因组通常位于细胞核内，比较稳定，序列和功能一般不受空间的影响，但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期，mRNA的表达是不一样的；不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞内不是静止的，他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用。2. 重点：基因组与蛋白组的区别与联系： 区别/联系基因组蛋白质组同一性与多样性同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的；对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下，蛋白质组的构成是不同的。有限性与无限性基因组无论大小，其核苷酸的数量和序列是一定的，例如人类基因组长度为32亿个碱基对；对基因组序列的测定是一种“有限”的工作。由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很难确定蛋白质组的蛋白质数量；对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。静态与动态一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变；个体的蛋白质组，作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中却总是变动的。周期性与空间性基因组通常位于细胞核内，比较稳定，序列和功能一般不受空间的影响，但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期，mRNA的表达是不一样的；不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞内不是静止的，他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用。孤立作用与相互作用基因组表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰；蛋白质组中的各种蛋白质却是彼此间有着广泛的相互作用。单一手段与多种技术在基因组研究中，DNA测序技术是最基本和最主要的工具，因为基因组的均一性和简单性使得一种单一的技术就能胜任基因组的研究任务；在蛋白质组研究中，需要的研究技术远远不止一种，并且技术的难度也远远大于基因组的研究技术。第2章 蛋白质概述名词解释：1. 等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。2、蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由20种左右天然-氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物；简答题3、氨基酸的分类、光学性质、重要化学反应1）非极性（疏水性）氨基酸(8种）A丙氨酸Ala、V缬氨酸Val、L亮氨酸Leu、I异亮氨酸Ile、F苯丙氨酸Phe、W色氨酸Trp、M甲硫氨酸Met、P脯氨酸Pre2）极性（亲水）中性氨基酸7种 G甘氨酸Gly、S丝氨酸Ser、T苏氨酸Thr、C半胱氨酸Cys、Y酪氨酸Tyr、N天冬酰胺Asn、Q谷氨酰胺Gln3）碱性氨基酸3种 H组氨酸His、K赖氨酸Lys、R精氨酸Arg4） 酸性氨基酸 D天冬氨酸Asp、E谷氨酸Glu2、光学性质1）除甘氨酸外，所有天然-氨基酸都有不对称碳原子，这其四个不同的取代基可有两种不同的空间排列方式，L型和D型。它们具有相反的旋光性，也称分子手性。 蛋白质分子中的氨基酸一般为L型。2）参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区（220-300nm）显示特征的吸收谱带，最大光吸收（max）分别为279、278、和259nm。由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。3、重要化学反应1）与茚三酮反应:用于氨基酸定量定性测定.2）与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应），用于蛋白质N-端测定.3）与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应），用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。（初级蛋白质测序）除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。第3章 蛋白质样品的制备可能会出论述题：蛋白质样品的制备包含蛋白质分离、提取与纯化3个过程。简答题：1. 样品制备的原则（1）全息性，尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失，尽可能获得所有的蛋白质。（2）应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。（3）细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。（4）防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。（5）样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 。勿反复冻融已制备好的样品。（6）通过超速离心清除所有的非蛋白杂质，尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。（7）防止发生人为的蛋白质样品化学修饰，如加入尿素后加温不要超过37 ，防止氨甲酰化而修饰蛋白。2.制备流程分为组织活细胞破碎、分离或沉淀蛋白质、纯化蛋白质。后两步往往是结合在一起进行的。1) 组织活细胞破碎的原则是，在整个过程中最大限度的限制蛋白质的水解和其他形式的蛋白质降解。2) 沉淀溶液样品中的蛋白质，清除杂质是可选择的步骤，主要依赖于样品本身和研究目的，通常建议采用最简单的样品制备方法。3) 蛋白质的纯化是对沉淀的蛋白质进行再溶解，重复沉淀的过程，通常利用冲泡胀溶液稀释样品。样品破碎与分离蛋白质3.组织与细胞破碎（一）温和的裂解方法通常应用于组分比较简单的样品，例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。（二）剧烈的蛋白裂解常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方法可以使细胞完全破碎裂解。4、蛋白质沉淀这是一种可选择的方法。如果样本十分重要， 想得到完整而精确的样本蛋白质谱， 应避免使用沉淀和重溶的方法。蛋白质裂解5、裂解液（各组分及其作用）组成成分及作用： 离液剂：通过改变或破坏溶液中的氢键等次级键使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。尿素是常用的离液剂。 还原剂：还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键，让大多数蛋白完全展开，增加蛋白的溶解性。 表面活性剂：表面活性剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。（4）起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。样品预分级6.分步裂解提取 1.目的与原理 由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。 2.方法：分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二步裂解液属传统的裂解方法，含有表面活性剂CHAPS、还原剂DTT、解聚剂Urea等成分，由于具有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白。第三步裂解液中添加了能够促进疏水蛋白质溶解的成分，如表面活性剂SB3-10、还原剂DTT、解聚剂thiourea，主要溶解偏疏水性的蛋白。在多数情况下，大部分蛋白质在第一步和第二步中可被提取。清除影响电泳的图谱的杂质样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分离及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备中需考虑清除这些杂质。第四章 蛋白质分离技术1. 双向凝胶电泳（2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。基本原理：第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。2. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）是通过丙烯酰胺（acrylamide）单体和双功能团交联剂如N,N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylamide）按一定的比例混合，在引发剂和增速剂存在下聚合而成的交叉网状结构，使其产生分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶的优点 机械强度高，弹性好，透明，无电渗作用，吸附作用极小； 化学性质稳定，与待分离的物质不起任何化学反应； 样品不易扩散，用量小； 凝胶孔径可通过改变单体和交联剂浓度调节 分辨率高。3、IEF原理等电聚焦电泳（IEF）是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。所以利用等点聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子。分析的条件是凝胶中有稳定的、连续的和线性的pH梯度。pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在pH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所带净电荷为零的点移动。 这就是等电聚焦效应。1）pH梯度的形成在电场下载体两性电解质的变化 天然pH梯度法：在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为6.5左右)。所有载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零。 引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移。2）pH梯度的形成过程 pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度而定。一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图 3）载体两性电解质的缺点n利用了合成载体两性电解质（SCA）来生成pH梯度，合成过程复杂，重复性小。nSCA的pH梯度不稳定且分子小易漂移，难以固定在IEF胶内，由于水合正离子引起的电渗流导致阴极漂移现象，是pH的不稳定性增加。n负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响很大。3. 固相pH梯度(IPG)原理：它利用一系列具有弱酸或弱碱的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度，然后将其共价键合在介质上，成为凝胶介质的一部分，从而形成固定的，不随环境电场等条件变化的PH梯度。4. SDS-PAGE电泳：原理：1）蛋白质分子解聚成亚基，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。 2）缓冲系统的选择：一般来说，在被分析的蛋白质稳定的PH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用。 3）凝胶浓度的选择：由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。不同分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。5. 双向电泳的局限性：(1) SDS等去污剂对蛋白质的变性作用是不可逆的。(2) 疏水性蛋白质因不能溶于SDS而不适合作2-DE；PI值11的蛋白质；分子量过大或过小的蛋白质；低丰度蛋白质n2）就会发生全反射现象，产生沿X轴方向传播而振幅衰减的一个波，即消逝波。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使得反射光的能量急剧减少。（二）分子生物学方法酵母双杂交系统、噬菌体展示技术 酵母双杂交酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞转录因子，特别是酵母转录因子GAL 4 性质的研究。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的，往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有N 端的DNA 结合结构域(DNA binding domain，简称为BD) 和C 端的转录激活结构域(activation domain，简称为AD) 。BD可识别DNA 上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游 ；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。当两者独立存在时, 无转录激活功能；但两者只要相互接近, 即可激活转录。酵母双杂交系统三个组成部分1 ）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；2 ）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称为猎物或靶蛋白（prey）；3 ）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等；有GAL4系统和LexA系统。酵母单杂交DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合，调控报道基因的表达，研究DNA与蛋白质的相互作用。酵母三杂交主要特征：蛋白X与Y的相互作用通过第三个分子蛋白Z的参与实现目的：研究两个蛋白质与第三个成分间的相互作用，按第三个成分的不同，可以是蛋白质、RNA 或小分 子药物反向双杂交反向双杂交系统（Reverse two hybrid system）特点：反选择筛选策略原理： URA3编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上，只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上 ，“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白，即与BD或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用，URA3基因不表达，则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。 噬菌体展示技术噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，为筛选到目的蛋白或多肽奠定了基础。优点：直接得到基因；高选择性筛选复杂混合物；直接评价蛋白质结合特异性原理：噬菌体展示技术是将待筛选的蛋白质插入到噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因8 或基因3 之间，构建成融合蛋白噬菌体文库，表达的融合蛋白呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链。利用目的蛋白与特定配基结合后，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质与编码遗传信息之间提供了直接的物理联系。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。三个基本因素：1. 在噬菌体p和p衣壳蛋白N端插入外源待筛基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别。2. 利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法（淘洗，panning），从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。3. 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序推导出来。噬菌体展示技术的局限性：（1 ）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109（2 ）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外，真核细胞蛋白在细菌中表达差，是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故。（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。第九章蛋白质翻译后修饰的鉴定这个章节，很可能会考，而且是论述题1、 名词解释：微观不均一性：糖蛋白存在着复杂的微观不均一性(microheterogencity)，即在蛋白质的氨基酸序列完全相同的情况下，由于糖链的组成或连接方式的不同而形成多种糖蛋白亚型。糖蛋白的这种复杂性在其生理功能上有其重要意义，但却给糖蛋白的分析带来了极大的困难。2、 N-糖苷键、 O-糖苷键N-糖苷键：N-糖基化通常是指糖链共价连接在蛋白质肽链上的天冬酰胺 (Asn) 残基的酰胺基、N-末端氨基酸残基的-氨基、赖氨酸或精氨酸残基的-氨基处。糖链与天冬酰胺残基的连接发生在三个残基的特殊识别序列 (Asn-X-Ser/Thr，其中的X为除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸）处。O-糖苷键：通常是指糖链通过N-乙酰葡萄糖胺连接在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸残基侧链的羟基处。3、磷酸化蛋白质组研究策略（大题）一、磷酸化蛋白质的检测 1. 32P放射性标记法 2抗体免疫印迹检测法二、磷酸化蛋白质的富集策略 富集的策略应用在磷酸化蛋白质组研究中，有两种不同的应用阶段，包括富集磷酸化蛋白质和富集磷酸化肽段。1磷酸化蛋白质的富集 磷酸化蛋白质抗体 这是目前富集磷酸化蛋白质的主要手段。 化学修饰2磷酸肽的的富集策略(1) 反相液相色谱(RP-HPLC)分离磷酸肽(2) IMAC分离富集磷酸肽 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography IMAC)最初用于纯化含组氨酸的蛋白质，现在常被用于选择性地富集磷酸化肽段，对磷酸化蛋白质的富集无效。 磷酸基团与固相化的金属离子通过静电作用吸附，可选择性地亲和提取磷酸化肽段，在碱性环境下或有磷酸盐存在时，这种相互作用被破坏从而使磷酸化肽段被洗脱。(3) 磷酸基团亲和取代三、磷酸化肽段的鉴定 1. MALDI-TOF-MS结合磷酸酶水解分析法，这是蛋白质磷酸肽鉴定的常用手段。2.串联质谱鉴定四、磷酸化氨基酸位点的确定 要确定其磷酸化位点，需要用串联质谱产物离子扫描模式对磷酸肽进行序列分析。五、蛋白质磷酸化的定量分析(1) 15N稳定同位素标记法(2)同位素标记的亲和试剂第十章 蛋白质组学定量技术名词解释：1、 细胞培养氨基酸稳定同位素标记（SILAC）：基本原理 分别用天然同位素(轻型、中型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸，主要是Lys和Arg，取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量，同时二级质谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。（在培养基设计时，该必需氨基酸必须是添加到培养基当中的。）2、 .荧光差异凝胶电泳 DIGE 简介：2 -D DIGE是一种在2-D 电泳之前标记蛋白样品的一种方法，可以对样品间蛋白丰度的差异进行精确分析。有两类提料可供选择Cy2、Cy3、Cy5最小标记染料，以及Cy3、Cy5 饱和标记染料，它们的分子量和电荷匹配，因而标记不同CyDye DIGE 染料的同一种蛋白将迁移到2 -D胶的同一位置 。最小标记法染料 Cy2只对样品中的少量蛋白进行了标记，因此称为“最小标而法”，用在容易获得多量样品的常规2-D电泳。标记肽段中赖氨酸残基上的氨基，都带一价电荷，取代标记后不会改变蛋白等电点。饱和标记染料 Cy3、Cy5与蛋白半胱氨酸残基的巯基基团共价结合。用于稀少样品标记。为了实现对半胱氨酸残基的最大化标记，标记时采用了荧光染料相对于标记蛋白的高比率，使得每一种蛋白的所有可能的半胱氨酸都进行了标记， 导致一个样品中蛋白质的大多数半胱氨酸基团都被标记。2-D DIGE内标：简答题：3.同位素标记亲和标签技术Isotope-coded affinity tag（ICAT）A: ICAT试剂结构:包括3个部分，亲和标签(生物素，biotin)，用来分离ICAT标记的多肽；连接子，用来整合稳定的同位素；活性基团，用来特异结合巯基(半胱氨酸)。试剂具有两种形式：重型（含8个氘）和轻型（含8个氢）。B: ICAT标记定量技术流程：来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂专一标记Cys，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。o优势: 1.将混合样品(来自正常和病变细胞或组织等) 直接测试；2.快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质、尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；3.快速找出重要功能蛋白质(疾病相关蛋白质) 及生物标志分子,进而快速用于疾病诊断；4.能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组织中绝大部分蛋白质； 5.烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸胍等)存在下都可进行； 6.只需分析含Cys残基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分析的复杂性； 7.ICAT允许任何类型的生化、免疫、物理的分离方法，因此能很好地定量分析微量蛋白质。ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。 （2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻，对小肽而言是一个较大的修饰物，会增加数据库搜索的复杂性。（3）由于ICAT在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化， （4）标记时通常需要延长时间来保证ICAT与蛋白质充分结合，这可能会造成赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸发生氨基酸局部衍化。 （5）与原子结合的硫醚键化学稳定性较低，可能会自发发生-消除反应使部分标签断裂。4、同位素标记相对和绝对定量Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification，iTRAQp基本原理： iTRAQ试剂为可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在串联质谱中，信号离子表现为不同质