高效液相色谱使用方法.doc

高效液相色谱使用方法一、 流动相准备将流动相按比例混合，注意混合的流动相必须相互溶解，最好能将流动相混合在一起，若相互溶解性不好，可分成两种。流动相配好后，将管路放入，注意不要将瓶口密封。二、 开机首先将真空泵打开，待泵的指示灯由黄变绿打；打开600泵开关，按Direct键，进入操作菜单。三、 抽气抽取管路A液体：先将注射器旋转插入，将旋钮由Run转至 Draw,抽液，完成后将旋钮由Draw至Run，再将注射器旋转取下，反复1-2次，抽至管路内无气泡。抽取管路B液体：在泵操作菜单上将B设为100%，给0.2ml/min的流速，听到泵转换的声音后，将流速设为0，以抽取管路A的步骤进行抽气。四、 调节流动相比例与流速在泵操作菜单上设定流动相比例，并以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml/min的速度逐步升高流速，每次间隔3-5分钟。五、 2410示差检测器的使用1、打开2410示差检测器开关2、调整检测器内、外温度3、实验前一天晚上，使用“purge”状态平衡过夜，若第二天还要做实验，结束工作后不关机，节省第二天的平衡时间，保持0.2ml/min的流速。六、 2487紫外检测器的使用1、 打开2487示差检测器开关，机器自动进入自检过程，约需7分钟。2、 设置检测波长3、 预热30分钟左右，即可注样测定。试验四、番茄内源激素高效液相色谱法测定一、样品准备取新鲜番茄根、茎、叶5克左右，液氮冷冻，放入冰箱储存。配80甲醇，冰箱冷冻。 二、提取样品放入预冷研钵，加l0ml 80的冰冻甲醇研磨至匀浆，转入小烧杯中，再用甲醇清洗研钵2次，每次l0ml，转入小烧杯中。小烧杯放入冰箱(04)冷藏14小时以上。三、过滤取出用漏斗滤纸过滤，并用10m180甲醇清洗残渣，合并滤液；如果提取液中沉淀物或色素多，则用10000g离心l012min，上清液转入冻干瓶中。四、浓缩将冻干瓶中的液体用减压蒸干机蒸干(至瓶中液体结冰)，然后用2m1 80的甲醇冲洗，如果有浑浊物，再次用离心机12000g离心l0min，倒入带有刻度的试管中，为保证试管中的液体有5ml左右，将不足5ml的试管中再加入一些甲醇。五、萃取提取液中加入等量石油醚萃取，用力振荡，待静止分层后，用胶头滴管吸取上层液体弃去，此过程反复进行，直至醚层不再有颜色。六、过柱纯化萃取脱色后液体吸入针管，通过C18小柱滤除色素，用12m1甲醇清洗小柱一次，若滤出色素，将液体吸回，用新小柱重新滤一次（小柱使用前要用甲醇浸泡，用后再用甲醇反复冲洗，再浸泡）。七、二次浓缩液体转入蒸发皿中，60蒸干，用lml甲醇洗脱。八、过滤045um滤膜过滤，滤液收集到小瓶中，冷冻待测定。九、测定与计算用标样做标准曲线，分别为10，50，100，200，500mgml。进样量为20ul。测定条件：流速为lmlmin，柱温设定为35，测定波长为260nm，流动相甲醇：3乙醇45：55计算：通过曲线计算样品中激素浓度。试验五、葡萄糖、果糖、蔗糖含量的HPLC测定一、取样称取样品（番茄(甜瓜)果肉重12 g、叶肉（无大叶脉）2g）置于试管（带玻璃试管塞）倒入80乙醇，浸没样品约1cm80水浴1h冷却后封存。二、提取倒出乙醇提取液入25ml容量瓶再向试管中加入80乙醇，80水浴1h，如此反复提取次合并提取液后定容三、浓缩取10-25ml溶液，加入蒸发皿中，放置在水溶锅上蒸干备用。四、过滤用1ml超纯水将蒸发皿中的糖全部溶解，吸入1ml注射器，过0.45m滤膜。若样品色素较多，需通过C18小柱进行脱色，然后再过滤。C18小柱使用方法：C18柱：甲醇（5ml）-乙醚（5ml）-80%乙醇（5ml）-样品-80%乙醇（样品量的二倍）-乙醚-80%乙醇-样品-80%乙醇五、HPLC测定测定方法及色谱条件为：Water 600E高效液相色谱，碳水化合物柱，柱温30-35，2410示差检测器，流动相比例为75乙腈：25超纯水，流速为1.0ml min-1,Water Millennium软件控制及数据处理。试验六：蔗糖代谢酶的测定一、试剂的配置（先溶解、快到1升时调PH值）1、50m M HePesNaOH(PH7.5)缓冲液体系配置(1升)50 m M HePes：11.9150gNaCl:16.0 gkCl:0.74Na2HPO4.12H2O:0.543葡萄糖：21m M EDTA:0.372210 m M MgCl:2.03302.5 m M DTT :0.3856 ()10 m M Vc 1.76142 、PVPP:固体3、0.1M NaHPO4-柠檬酸（PH4.8）0.2M NaHPO4（35.8/500ml 9.86ml ）0.1M柠檬酸 (21.01g/L 10.14ml )4、0.1M NaHPO4-柠檬酸 PH：7.20.2M NaHPO4 17.39 ml0.1M柠檬酸 2.61 ml5、0.1M蔗糖：3.4229g定容至100 ml6、2N NaOH:8g NaOH定容至100 ml7、30%HCl:39.5ml浓HCL加入到10.5 ml 水中8、0.1%间苯二酚：95%乙醇+0.1 g 间苯二酚定容至 100 ml9、0.05M F-6-P0.2020g F-6-P+5 ml0.1 N HCl + 数滴10%K2SO4至白色沉淀不在形成，10000g离心10分钟，弃沉淀，上清夜+1N NaOH调PH=7.0 10 ml10、UDPG：0.205g/25ml11、Tris:0.1M ,仅是Tris，无盐酸12、5 nM MgCl2 13、0.1N HCl:0.862 ml HC定容至100 ml14、0.05M 果糖。15、DNS试剂将6.3 gDNS和262ml 2 M NaOH溶液，加到500 ml含有185g酒石酸钾钠的热水混液中，在加5g结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 ml，贮于棕色瓶中备用。二、样品测定.1g样品 冰浴研磨(加少量石英沙) 匀浆四层纱 + 0.5g pvpp + 3mlHePES + 3mlHEPES + 4mlHepes 布过滤 12000g(4)弃沉淀上清夜+6.0g硫酸铵(放置15分钟)20分钟使之完全溶解 12000g(4)弃上清夜 3mlHepes溶解沉淀 移到透析20分钟 袋中 用稀释10倍的Hepes(不含pvpp )4培养箱中透析20小时(以上操作均在04下进行) 、酸性, 中性转化酶的测定(mol Glucoseh-1g-1FW) 酸性转化酶0.6ml(0.1M Na2HPO4 柠檬酸 PH4.8 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的) 中性转化酶0.6ml(0.1M K2HPO4 柠檬酸 PH7.2 + 0.2ml(0.1M蔗糖) + 0.2ml酶提取液(透析后的)总体积为1ml(放在小离心管中) 37孵育30分钟后 转到试管中+1ml蒸馏水 +1.5ml 3,5-二硝基水杨酸（DNS） 空白2ml蒸馏水 沸水浴5分钟 流水冷却 每管中加21。5ml蒸馏水 520nm比色。 葡萄糖标准曲线012345678葡萄糖标准液（ml）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS试剂（ml）1.51.51.51.51.51.51.51.51.5沸水浴5分钟，立即用自来水冷却蒸馏水（ml）215215215215215215215215215OD520nm、蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性测定(mol Sucroseh-1g-1FW)蔗糖合成酶 0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml(0.0082 g/ml UDPG)+0.1ml(0.1M Tris)+0。1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液 蔗糖磷酸合成酶 0.1ml(0.05M F6P)+0.1ml UDPG+0.1ml(0.1M Tris)+0。1ml(5mM MgCl2)+0.2ml酶液上述反应在37保温30分钟 100水浴1分钟 定容至1ml 调零1ml蒸馏水 +0.1ml(2N NaOH) 沸水浴10分钟 流水冷却 转到试管中 +3.5ml(30%HCl) +1ml(0.1%间苯二酚)（用95%乙醇溶液） 摇匀 80水浴10分钟 流水冷却 480nm比色 蔗糖标准曲线配制 先配制200g/ml的蔗糖溶液0123456蔗糖标准液（ml）00.10.20.40.60.81.0加蒸馏水（m