分子流行病学概述及我国分子流行病.ppt

分子流行病学概述及我国分子流行病学研究现状 提纲 一 分子流行病概述 一 定义 二 分子流行病学研究内容和范围 三 分子流行病学常用的主要研究方法二 我国分子流行病学研究现状 一 病原体分型和检测研究 二 人群中疾病流行规律 传播机理研究 三 在慢性病研究中的应用 四 在遣传性疾病研究中的应用 五 在疾病防治方面的应用三 存在问题和前景 一 存在问题 二 前景 流行病学是研究人群中疾病和健康的分布 探索影响分布的因素 并在此基础上制定预防策略的措施的一门学科 一直以来 流行病学在疾病的预防和治疗 疾病危险因素的研究和控制方面都起着十分重要的作用 近二三十年来 生物学技术尤其是分子生物学技术取得了突破性进展 并逐渐渗透到各个医学领域 分子生物学的理论和技术不断应用于传统的流行病学 并在此基础上形成了一门新的分支学科 分子流行病学 一 分子流行病学概述 一 定义分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志 结合流行病学现场研究方法 从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程 并提出与评价相应防治措施的科学 这一定义包含了几个要点 1 分子流行病学是流行病学的一个分支 是传统流行病学与新兴的生物学技术 特别是分子生物学技术之间的一门边缘学科 交叉学科 2 分子流行病学的主要研究对象是各种生物学标志 3 与传统流行病学不同 分子流行病学还研究暴露因子引起疾病的相关过程 以测定各种易感性标志 并提出针对性预防措施 尤其是阻断暴露因子进入体内后致病进程的初级预防措施 图1传统流行病学与分子流行病学的关系 Schulte 1993 表1传统和分子流行病学的比较传统流行病学分子流行病学推动力公共卫生现代科学研究水平人群个体 器官组织 细胞 分子研究样式人口统计学 社会科学临床 实验认识论策略自上而下自下而上预测水平人群个体 综合上述国内外学者的分子流行病学研究实践及其对分子流行病学的理解 提出如下定义 分子流行病学是应用先进的实验技术测量生物学标志 结合流行病学现场研究方法 从分子水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程 并提出与评价相应防制措施的科学 1 疾病病因的探讨疾病的发生 大多是环境因素与遗传因素同时起作用 只是有些疾病以环境因素为主 有些则正好相反 遗传因素起重要作用的疾病往往与基因有关 这不言而喻 而很多与环境因素有关的疾病 也常常需从基因方面去研究 因为环境因素可以通过宿主的基因突变或异常表达引起疾病 因此 分子流行病学研究在这方面起着非常重要的作用 二 分子流行病学研究内容和范围 意大利学者Dragani在1996年名古屋会议上报告 以前一般认为肺癌的家庭聚集性很少见 故基因因素的作用很小 但他从小鼠模型发现染色体上存在易感或抑制肺癌的基因位点 此后作者在人群中选择病理确诊的肺腺癌125例作为病例组 另在健康供血员人群中随机选择179名作普通人群对照检测显示 在KRAS2基因第2外显子下游有个基因位点与拮抗肺癌产生并延长肺癌患者的生存期有关 表2肺腺癌病人和普通人群对照中KRAS2Rsal等位基因的基因型频率 基因型a 普通人群 肺腺癌 观察数 期望数b A1 A1A1 A2A2 A2 966815 89594 81 557 812 7 计 179 152 152 注 a 等位基因A1为无酶切位点 A2为有酶切位点 b 按普通人群的频率推算所得 c 卡方检验 0 025 2 危险因子致病机制的研究分子流行病学不仅研究环境与宿主体内的致病因子 而且着重研究这些致病的危险因素 特别是化学物质与生物活性物质从暴露开始至疾病发生全过程的各个环节 癌症发病的分子流行病学研究是个典型的例子 20多年来 对与癌相关的各种生物学标志 致癌物的种种生物效应标志 如DNA加成物 adduct 等等进行了十分广泛的研究 有关报道相当丰富 积累了很多资料 提出了一些很有意义的假设 目前认为 致癌化学因子进入体内 最终引起临床癌症过程的基本框架大致如下 致癌作用是多阶段的 正常细胞转变为癌细胞经历了致癌作用累积而又连续的几个阶段 启动 initiation 促进 promotion 转化 conversion 和发展 progression 在启动阶段 机体暴露于环境致癌化学物质 致癌物进入体内需经代谢活化 metabolicactivation 变成反应性亲电物质 reactiveelectrophilicform 再与DNA反应形成DNA加成物 在致癌物进入体内后 这种反应通常仅需几小时就可完成 当DNA复制时 这种对DNA的化学损伤可引起基因的变化 这些基因的变化如果逃避了DNA修复作用 就会被固定下来 某些基因损伤可造成癌基因的活化或抑癌基因的失活 从而使正常细胞变成启动细胞 这个过程往往仅需几天时间 但促进过程却是人类致癌过程中最长的阶段 启动细胞呈克隆样扩展需10年甚至更长 促进阶段的细胞还需经过进一步的基因改变 并获得侵袭性与转移的恶性表型 才能进入转化与发展阶段 而这后2个阶段大概需1 2年的时间 图2分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略 3 疾病易感性的测定个体对疾病都存在一定的感受性 称之为易感性 以往一般认为 只有传染病才有确定的易感性 可以用测定机体内是否存在某种特异性保护 中和 抗体的方法了解其对某种传染病是否具有易感性或免疫力 然而 近来分子生物学与免疫学研究发现 机体对很多疾病也同样存在着易感性 且往往与个体的某些基因型别或序列或其表达产物有关 如果与遗传有联系 往往称之为遗传易感性 尤其慢性病 同时还发现很多传染性疾病的易感性 除了与能刺激机体产生特异性抗体的致病微生物有关外 也和机体的某些基因类型有联系 因为后者决定了机体对致病微生物的免疫反应的方式与强度 对于常见的慢性疾病的遗传易感性的分析 可以应用同时检测特异基因标志的病例对照研究进行 例如 如果某个特异性的等位基因在某病病人中明显高于对照 这就提示该等位基因的存在可能使机体对某病具有一定的易感性 目前 与遗传易感性相关研究较多的一个基因区域是人类第6号染色体短臂上的人类白细胞抗原 HLA 其原因可能有二 首先HLA基因区有高度的多态性 其次为HLA的功能是介导对特异性抗原的免疫反应 Erlich的研究发现 HLA 类单倍体 DRB1 1501 DQB1 0602 的比例在受到人乳头瘤状病毒 HPV 16型感染的宫颈癌与重度异常增生的病人中明显升高 4 流行规律的研究这方面研究最多的是传染病 在传播范围的确定 传播途径的判断与传染源的追索方面 分子流行病学可以发挥无与伦比的作用 因为以往常常是根据宏观流行病学调查分析 再辅以病原体分离与血清学分型来分析流行规律 然而近年的很多分子流行病学的研究表明 上述的方法有时不够精确 例如 尽管传染源与接触者之间的病原体的血清学型别一致 但如果基因型不一致 就不能确切判定两者的传播关系 1 传播范围的确定按照传染病流行病学基本理论 在一次爆发或流行中 其受染范围的确定应根据如下原则 在爆发或流行期间 有共同或有效暴露史 经过一个平均潜伏期发病或出现急性感染的生物学标志可判定为受染者 然后总计受染人员 结合这些人员活动的区域 以确定受染或流行涉及范围 可是 过去测定的生物学标志主要是属于血清学 免疫学 微生物学范围 缺乏基因型标志 因而可能出现错误的判断 分子流行病学研究缩小了常规流行病学调查所推测受染范围 从基因水平上证实爆发的受染人数与传染来源 2 传播途径的判定以往 传染病流行中传播途径或传播媒介的调查通常使用排除法 同时尽可能在媒介物中分离到引起流行的病原体或检测到病原学标志 近来分子流行病学研究引入一些新的技术 如分子进化诊断 molecularevolutionarydiagnosis 例如 不少分析性流行病学研究与血清流行病学研究均认为丙肝病毒 HCV 可经性传播途径感染配偶 然而 出人意料的是 在1993年东京国际病毒性肝炎会议有2篇报道 用分子进化法进行的研究提出了相反的意见 如Ohno筛检50对至少有一方抗 HCV阳性的夫妇 发现仅4对夫妇双方抗 HCV均阳性 用PCR扩增 测序分型 结果其中2对配偶男女之间的HCVRNA彼此的基因型别不同 由此可排除性传播所至 另2对夫妇之间型别相同 用分子进化诊断判定男女病毒株的分株时间 divergencetime 发现第1对配偶的分株时间发生在45 52年前 而结婚却才32年 第2对配偶分株时间已有30 34年 结婚时间则在25年前 基于这些研究结果 作者认为HCV经性传播的可能性很小 3 传染源的追索判定传染来源或两人之间的传播关系应符合如下4条原则 A 传染源 与B 受染者 的接触是有效接触 暴露 接触发生在A的传染期内 B的发病时间是在暴露后该病最短与最长潜伏期之间 A与B受染致病的血清学型别一致 如今看来 第 条应该用基因型别来代替 而基因序列的测定与型别差异的鉴定虽然比较复杂与精细 但可靠得多 美国1990 1991年报道佛罗里达一个口腔诊所有1名患有艾滋病的牙医 被他看过病的患者中有7名后来感染了HIV 然而经过分子流行病学研究发现 其中5名患者的HIV与牙医的HIV有共同的氨基酸特异模式 signaturepattern 而且序列的差异率 5 0 为同一病毒株 而另2名患者的HIV则与牙医的不同 因此 通过序列分析 从分子水平确定了前5名病人的HIV感染是由牙医引起 而后2名病人的传染来源则不是牙医 5 防制措施的研究 1 传染病预防因为在传染病流行的研究中应用了分子生物学等现代技术 对传播与流行范围的确定 传播途径 传播媒介与因子以及传染来源的推断更为精确 所以提出的控制措施更有针对性 更有成效 传染病预防中最可靠的手段是疫苗接种 已有很多传染病由于实施了安全 有效 广泛的免疫接种 发病率已大幅度地下降 但少数疫苗由于某些原因可以使极个别疫苗接种者发生被免疫的疾病 过去 仅能根据接种史与分离病原体作血清学或生化反应来进行判断 但可靠性不强 而现在用分子生物学技术作基因序列分析可以确实地判定是否为疫苗株引起的发病 2 非传染病的预防由于分子流行病学不仅研究疾病的危险因素 而且研究其引起疾病整个过程中的所有环节 也即研究这些致病因子的致病机制 因此 这就为疾病的三级预防特别是第I II级预防采取针对性措施奠定了科学的基础 在这个意义上也可以说 分子流行病学的建立 为疾病的三级预防开辟了十分广阔的前景 图 2以癌症为例 描绘了应用分子流行病学方法研究致癌因子导致正常细胞基因改变 选择性克隆扩增 基因改变 细胞异质化 临床癌症过程的主要阶段 以及针对这些改变所能采取的不同阶段的具体预防与干预措施 防止暴露 预防最终致癌因子的形成 阻断其与宿主基因间的相互作用 抑制癌前起始或启动细胞的产生 抑制选择性克隆的扩散 早期诊断 手术与放射治疗 化学治疗 预防复发与继发肿瘤 图2分子流行病学和癌的发展过程及其三级预防策略 分子流行病学在某种意义上讲 是一种流行病学宏观与实验室微观结合的方法学 需要现场流行病学调查研究与实验室先进的检测技术相结合 因此 分子流行病学的研究方法大致可以分为二大类 实验室技术与流行病学现场研究方法 三 分子流行病学常用的主要研究方法 1 实验技术 1 基因序列分析通过需测定的基因 靶基因 序列提取 克隆入测序载体或用PCR直接电泳测序 这是测定基因核酸序列及其类型 突变部位与方式的最可靠的方法 在传染病与非传染病分子流行病学研究中都十分常用 但技术操作比较复杂 分析也需细致并具备一定经验 在国内 目前还只在一些大学 研究所 大医院等开展 表3常用检测基因变异方法 表3基因变异的检测和筛查方法比较 注 可用 不宜用 A 完全确定 B 不完全确定 C 不能确定 2 分子进化分析 molecularevolutionaryanalysis 用核酸序列测定技术结合计算机分析 确定流行中感染的病原株之间的亲缘关系和序列突变时其时间 以研究传播关系和病原体的进化 所以目前主要用于传染病的研究 3 单链构象多态性 single strandconformationpolymorphism SSCP 分析其简要操作步骤与原理为 将被检的靶基因PCR扩增后变性为单链核酸 然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 观察区带的迁移率 由于迁移率与核酸的构象密切相关 甚至1个碱基的突变都可以改变构象 产生电泳迁移率的差异 因此 藉此可以检出基因的突变 而不需要测序 SSCP简便 价格便宜 已被很多学者应用传染病与非传染病的研究 国内也有些单位在使用 然而由于影响因素多 需要操作技术熟练 重复性差 尚未被普遍使用 另外 SSCP不能判断DNA变异的确切部位与方式 如要作深入研究 还需进行序列测定 4 基因芯片技术 DNAchip 基因芯片是指固定有许多有序列的寡核甘酸探针的载体 通过杂交检测 对各种基因进行分析 由于它所具有的高通量性 快速 敏感 便宜等优点 在多个领域起到越来越重要的作用 基因芯片基本原理是通过原位杂交方法 用已知的DNA序列检测未知序列 目前主要用于DNA突变分析 基因谱差异分析 基因诊断分析和大规模基因类型分析 其研制技术主要包括以下几大步骤 寡核苷酸探针合成 固定 杂交和检测 2 现场分子流行病学研究方法传统的现场流行病学研究方法 即描述性研究 分析性研究与干预性研究均可应用于分子流行病学 也可以说 在传统的流行病学研究中 结合检测一些生物学标志 以从分子水平更深层次揭示病因联系或致病因子的致病机制 目前较常用有2种 1 巢式 套式 嵌入式 病例对照研究 nestedcasecontrolstudy 运作开始是按队列研究的方式进行 选择一队列 收集基线资料 采集所需研究的生物学标志的组织或体液标本储存备用 然后随访到出现能满足病例对照研究样本量的病例数为止 把这些病例作为病例组 按配比条件 从同一队列中选择1或数个非病例作对照 抽出病例与对照的基线资料并检测收集的标本 资料按配比病例对照研究处理 其他的非病例及其资料 标本均可不用 由于此种研究是按队列研究设计进行 资料收集和生物标本采集均在发病前 观察的又是生物学标志 故因果关系清楚 资料可靠 论证强度高 而标本检测与资料处理又按病例对照研究方法 故省钱省时省力 可以说兼有队列研究与病例对照研究两者之优点 2 病例 病例研究 case casestudy 在病例对照研究的病例组中 临床类型可以不同 如脑卒中有出血型 缺血型 冠心病有心梗型 无心梗型 某些生物学标志往往也是不均一的 即部分病例有某种生物学标志 而其余的则没有 那么就可把不同的临床类型或具有标志的这些病例与无标志的病例 按病例对照研究的方式处理资料 以探讨不同临床类型的危险因素的差异或者这个生物学标志与该疾病的其他危险因素之间的关系和相互作用 这就能比普通病例对照研究提供更多的信息与线索 在病例对照研究的基础上再作如此处理 可达到事半功倍之效 或者使用单纯病例 病例研究可免除选择对照 特别是免除从无病对照中采取生物标本的麻烦与困难 如食管癌的病例对照研究中发现 130例食管癌患者中 用免疫组化检测到p53基因表达异常的有68例 按病例 病例研究处理 无论是单因素或Logistic回归分析 均显示吸烟 食管癌家庭史与p53基因表达异常有关 OR值分别为2 3 3 2和2 8 3 8 吸烟还有剂量效应 表明吸烟与食管癌家族史很可能是食管癌p53基因异常表达的危险因素 二 我国分子流行病学研究现状 国内自1985年始 将分子生物学技术和方法 DNA杂交 基因酶切图谱分析 序列分析 DNA AAA 和PCR等技术应用于流行病学中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究 使疾病早期快速 可靠的基因诊断提供了手段 而且使基因分离 克隆表达与序列分析等技术更加简便 高效 另一方面由于流行病学研究的深入 一些传统的表型 Phenotype 检测方法 如染色 形态 培养特征 生化反应 血清学试验等已不能完全满足疾病的病因与传播途径精确判别的需要 也不能完全适应一些非传染性疾病病因及制病制理的探讨 因此 在短短的十几年中 国内分子流行病学经历了由产生到起步发展的过程 并取得重大发展 一 病原体分型和检测研究分子流行病学研究最早开始用于传染病的病原体基因分型 并调查病原体的分布规律 在传染流行中 对病原体进行准确的分型 对疾病的防治十分重要 由于病原体表型特征的不稳定性和易变性 以表型特征研究的分型方法 如血清学 生化学等 就存在缺陷 而基因型是遗传特征 相当稳定可靠 可以作为病原体鉴定和诊断的重要依据 细菌的产毒 耐药特性都与细菌质粒有关 徐兆炜等 1986年 对在同一地区分离的134株痢疾杆菌进行质粒图谱分析 发现虽然部分菌株耐药谱不同 但仍可呈现为相同的质粒图谱 这对鉴定菌株 追踪耐药菌株来源极有帮助 rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA的DNA序列 属保守基因序列 徐文斌等 1996年 对不同地区 不同时间分离到的119株伤寒沙门氏菌进行rRNA RTs 的基因多态性分析 119株细菌可分为38个RTs 其中RT9和RT11是造成我国伤寒流行的主要RTs 对于病毒的分型 可以采取先进行病毒的细胞培养 病毒增殖到一定程度后 提取病毒DNA 再进行限制性内切图谱分析 PCR技术的出现 使对病原体分析过程更加简化 快捷 首先设计引物 PCR扩增病原体DNA中一段保守的基因片段 然后进行酶切分析 例如 苏虹等 1997年 利用逆转录 多聚酶链反应 RT PCR 和限制性片段长度多态性 RFLP 分析安徽HCV基因型的分布 结果表明 安徽HCV感染以II型为主 其中北部地区III型感染多于南部 而II型北部少于南部 对病原体的基因型 多态性 变异型可以应用单链构象多态性 SSCP 脉冲场电泳 PFGE 以及序列分析等多种方法进行分析 基因的多态性也表现为酶分子的多态性 对酶分子的多态性的研究 也可了解不同病原体间遗传关系 分类分型 段广才等 1996年 应用多位点酶电泳法 MEE 对471株霍乱弧菌进行分类 结果证实古典型和埃尔托型流行株遗传关系紧密 非流行株相互间流行关系较远 O139群与O1群流行株有相同的霍乱毒素 CT 片段 应按流行株对待 对病原体的检测 以往多使用病原体培养 生化分析 血清学和免疫学检测等 上述方法都存在各种缺陷 如检测时间长 灵敏度 特异度不高等 利用放射性同位素标记探针检测病原体 是一种灵敏 特异的检测方法 除用同位素标记探针外 更多的使用非同位素如地高辛 生物素等标记探针 增加了安全性 核酸分子杂交方法检测病原体 在流行病学研究中应用日益增多 王云飞等 1994年 对不同基因型人乳头瘤病毒 HPV 在宫颈癌 尖锐湿疣等中起不同作用进行了研究 证明HPV11 6型引起性传播的尖锐湿疣 而HPV16 18型则与宫颈癌关系密切 HPV52 58型与宫颈关系还有待证实 PCR不仅可以用基因分型 克隆和序列分析 还可用于检测病原体 郭恒彬等 2002年 以构建的Rt外膜主要蛋白56kDa型特异抗原 tsa56kDa 基因编码区的群 型特异引物 采用1步法PCR分别对Gilliam Karp Kato Kawasaki和Kuroki5株标准株Rt 江苏地区5份Rt阳性标本 斑点热和莫氏立次体以及5份正常输血员全血标本进行检测和分型 研究结果证明所构建的Rt群 型引物具有Rt的特异性 型特异引物在Rt的型与型之间无交叉扩增 因此 该研究对恙虫病的诊断 流行病学调查以及Rt的型别鉴定具有实用价值 2003年全国SARS爆发流行 用分子流行病研究其病尤为必要 如SARS在广东流行可分三个阶段 早期由病人分离到的SARS病毒与果子狸分到的SARS病毒只差27个碱基对 因此怀疑SARS是一种动物来源的病 中期SARS病毒分子结构稳定 病毒传播力强 超级传播事件发生多 后期SARS病毒碱基短缺可达几百个 病毒的传播力大大减少 2004年4月苏北某镇在学龄儿童中爆发一种病 疾症状以发热 上感和扁桃体肿大为主 病人虽发热39 但还能骑自行车外出 无肺部征象 到6月份 全镇共发生783例 少数病例培养出链球菌 用各种抗菌素后未能控制 5月11日全镇停课 但病例未能减少 6月1日重新上课 6月4日药费了20万元 用阿奇霉素口服预防 随着病情渐缓 疾病有向周边扩散趋势 针对这一原因不明疾病 我们首先对20例病人进行了细胞培养 20例中14例有细胞病变 70 经诊断是一种腺病毒感染 其中半数以上荧光抗体和PCR阳性 再进行序列测定证明为腺病毒3型的一次流行 二 人群中疾病流行规律 传播机制研究目前疾病在人群中流行的现象比以往更加复杂 已由三环节二因素向三要素 甚至四要素发展 病因已由单病因 单效应 向多病因 单效应 甚至多病因 多效应发展 传播机制也由水平传播 垂直传播 母婴传播 到混合传播 疾病侵入人体途径亦日益复杂 疾病中隐性病例与显性病例的比例不断上升 非典型和隐性感染者越来越多 传染病的潜伏期和非传染病的潜隐期也越来越长了 而发病的频率则越来越低 因此 使用传统的检测方法 调查传染源 传播途径 确定疾病流行规律 就往往存在一定的困难 解决上述困难的主要途径之一是发展分子流行病学 使检测手段更加先进 敏感度和特异度更高 HBV的垂直传播一直是人们关注的问题 既往的有关研究 都缺乏直接的证据 证明垂直传播的存在 唐时幸等 1991年 使用核酸分子杂交法 从胎儿胎盘组织中检测到HBVDNA 说明HBV可通过胎盘屏障感染胎儿 而且调查还发现 母亲HBVDNA阳性 胎儿宫内感染的机会大大增加 HBV可以通过母亲传染给胎儿 还可能由父亲传染给后代 王培林等 1998年 对乙型肝炎患者家系进行分子流行病学调查 比较男性患者病前所生子女HBVDNAU5样序列片段检出率及HBsAg HBeAg和抗 HBc阳性率 都显著低于男性患者病后所生子女 提示HBV可能通过HBVDNA整合的精子 使后代感染HBV 分析病原体 分离鉴定其亚型 对于追踪传染源和传播途径 采取相应的预防措施 有重要意义 2003年阴宁等对中国经血传播人群中艾滋病病毒 1与丙型肝炎病毒亚型分布研究中 以聚合酶链反应 PCR 技术扩增HIV 1gag的p17区和env的C2V3区 HCV5 NCR区和E1 E2区 并对扩增产物进行测序 采用ClustalW软件对所得序列进行基因树分析 结果共检测了239例HIV 1感染者 其中HCV阳性率为56 9 136 239 在136例HIV 1 HCV混合感染者中 93 6 是通过静脉吸毒 IVDU 和不洁献血途径而感染的 其中HCV基因型为1b 3a 3b和4型 而不洁 输 献血人群的HIV 1主要为B型 其HCV基因型以1b和2a为主 三 在慢性病研究中的应用随着生活水平的提高 以及疫苗的广泛使用 传染病的发病率和死亡率逐渐降低 而心血管病 肿瘤等慢性疾病的发病率和死亡率在不断上升 成为威胁人类健康的主要疾病 因此 对慢性病的病因研究有重要意义 1肿瘤 1 癌变是一个复杂的多阶段过程癌变过程的复杂性和对致癌因素反应的个体间差异 是肿瘤分子流行病学的两条基本原理 两者的相互作用构成了癌变的复杂多阶段过程 癌变的复杂性体现在它是一个多因素 多基因和多途径的过程 癌变过程的中心生物学事件是癌基因的活化和抑癌基因的失活 引起这些改变的除DNA序列变化外 目前认为表遗传学改变 epigenetic 指仅影响基因的活性 而不改变基因的结构 如DNA甲基化程度等 产生可遗传的表型的改变 也起重要的作用 以往认为 癌变按启动 促进和演进的三个阶段的发生模式 从目前大肠癌等完成的研究结果看来 这个模式有些简单化 实际上癌相关基因的改变发生在癌变的每一阶段 它促进了具有生存优势克隆的选择性扩增和细胞恶性程度的提高 在不同类型的癌 甚至同一种癌的独立起源癌灶间 所发生遗传学改变的关键基因种类 数目和顺序都可能是不同的 这些提示 可能存在多种基因功能异常的途径导致肿瘤的形成 2 生物标记分子流行病学应用经验证与人癌变过程相关 存在于细胞 组织和体液中的生物标记 biomarker 鉴定癌的危险因素 评价个体肿瘤易感性 从暴露人群筛选高危个体和亚群 检出临床前早期生物学反应和形态学改变 为早期的预防和干预提供了机会 因此生物标记的研究在分子流行病学研究中起着重要的作用 生物标记通常分为三类 暴露生物标记 包括内部剂量如体液中致癌物或其代谢产物的浓度 以及效应剂量如DNA加合物 效应生物标记 包括早期生物学改变如染色体畸变 微核和基因突变等 以及与癌变相关的形态结构和功能的变化等 易感性生物标记 包括癌相关基因的多态性等 目前研究较深入的三个代表标记均与遗传学相关 DNA加合物致癌剂残基与DNA共价结合形成的加合物 提供了特殊致癌剂暴露和原始DNA损伤的证据 并反映了外源性致癌剂暴露 吸收 代谢和DNA修复等相关易感性因素互相作用后的综合效应 其中PAH DNA和AFB1 DNA加合物被成功地用来证明PAH和AFB1分别为肺癌和肝癌的重要危险因素或病因之一 突变谱突变谱是指经诱变剂作用后 基因内突变体的分布情况 主要是由突变热点所决定 p53抑癌基因在细胞的正常功能调控和癌变过程中起重要作用 是研究突变谱的理想候选基因 大量研究表明 p53基因内的错义突变是非随机分布 在不同类型的人类癌症中发现了突变热点 热点的产生是由于特定密码子对特殊致癌因子的易诱变性 或是某种突变细胞的选择生长优势和克隆扩增的结果 若一种致癌因子诱发的肿瘤总产生同样的突变谱 则支持该因子起病因作用 致癌因子暴露与癌症间的分子联系最好的例证是肝癌 皮肤癌和肺癌的p53基因的突变谱 表4 另一方面 内源性机制产生的突变谱则不同于因暴露诱发的突变谱 例如 在大肠癌发现2 3以上的突变是C T碱基转换 表4致癌因素暴露 p53基因突变和癌 暴露 癌的类型 P53突变 食物中的AFB1U V 烟草烟雾 肝细胞肝癌皮肤鳞癌和基底细胞癌肺癌 G T或G C颠换 特别是密码子249在二聚体位置的C T转换G T颠换 特别是密码子157 248 273 遗传多态性遗传多态性或变体是指在一个群体中 特定位点上经常同时出现两个或两个以上的等位基因 其中最低的等位基因频率远超过基因突变频率 遗传多态性的分子基础是DNA序列的变异性 其中约90 为单核苷酸多态性 SNP 积累的大量研究资料表明 代谢酶 DNA修复蛋白和受体等的基因的多态性 决定了肿瘤等疾病的易感性 药物的反应性和疾病临床表现在不同人群和个体间的差异 由于这些等位基因在人群中常见 故在肿瘤等疾病防治中意义重大 近有消息 国际学术界和公司协作绘制人类基因组变异图谱 这将使发病和预防机制的研究进入分子水平 2 心血管疾病心血管疾病包括高血压 冠心病和动脉粥样硬化等 其病因可能与多种因素 如饮食 紧张焦虑 遗传等有关 而分子流行病学则进一步从基因水平对其病因进行研究 脂蛋白脂酶 LPL 能促进乳糜微粒和极低密度脂蛋白中甘油三酯 TG 分解 如果LPL活性降低 TG含量增高 高密度脂蛋白胆固醇 HDLL 降低 导致冠心病的产生 钱卫冲等 1998年 对106例冠心病病例的病例对照研究发现 LPLPVUII 基因型和单倍体基因型H P 是冠心病的危险因素 HDL C和APOA B是保护因素 LPLPVUII 基因型与非LPLPVUII 基因型的OR值是17 18 H P 基因型与非H P 基因型OR值为3 67 除肿瘤和心血管疾病外 分子流行病学还更广泛研究其他慢性疾病 如糖尿病 自身免疫疾病等疾病的病因 高危人群的筛选及早期诊断等 四 在遗传性疾病研究中的应用分子流行病学在非传染病研究中阐明遗传易感性方面发挥了极大的作用 血管紧张素转化酶基因 ACE 位于染色体17q23 包括26个外显子和25个内含子 16内含子中的一段287bp的插入 缺失 I D 多态性 导致3种基因型 插入纯合子型 II 缺失纯合子型 DD 和杂合子型 ID ACE基因缺失型与冠心病 心肌梗死等发病显著相关 沈丹等 1998年 研究ACE基因多态性发现 高血压合并脑梗死的DD基因型频率29 6 及D等位基因频率56 8 都显著高于正常组12 8 和46 ACE基因缺失型可能是造成中国人高血压合并脑梗死发病的重要遗传易感因素 遗传易感因素的研究 为筛选高危人群提供了线索 还有一些单基因遗传性疾病更需要从群体遗传学角度研究 其发病机理是单个基因或1对等位基因缺陷或发生突变所引起的 如果能从群体角度研究其遗传规律 将有重要意义 视网膜母细胞瘤是单基因遗传病 是由于位于13q14的Rb基因的突变或失活所致 目前公认生殖细胞起源的Rb基因的突变决定了患者发生视网膜母细胞瘤的遗传易感性 黄倩等 1998年 检测79个有Rb基因突变的视网膜母细胞瘤家系中 25例查出体细胞起源的Rb基因突变 其余54例为生殖细胞起源的Rb基因突变 其中36例突变是新生的 15例突变由亲代遗传 3例为基因突变嵌合体 五 在疾病防治方面的应用进行疫苗的预防接种 是保护易感人群最有效 最经济的方法 使用灭活或减毒活疫苗 存在免疫原性差 毒力回复 疫苗需冷冻或冷藏等缺点 利用分子生物学技术 将DNA重组 构建载体 利用细菌等表达大量的蛋白质作为疫苗 如目前广泛应用的乙型肝炎 乙肝 疫苗 就是将乙肝表面抗原基因连接到适当的载体上 然后在酵母或哺乳动物细胞中表达而得到