Biovue血型卡在新生儿溶血病检测中的应用.doc

母婴血型不合导致新生儿溶血病的实验室检查母儿ABO血型不合,激活母体免疫系统,产生对胎儿红细胞抗原的特异抗体,其中IgG抗A (B)抗体是引起新生儿溶血病(HDN)的主要原因之一。现在临床上常用经典抗人球蛋白法(经典法)检测血清IgG抗A (B)抗体预测HDN发生的可能性,此方法操作复杂且耗时长,限制了临床的应用。柱凝集试验操作简便，结果准确，敏感度高，标本用量少等原因迅速替代了经典的抗人球蛋白试验，成为各医院的首选方法。现就Biovue柱凝集试验在母婴不合新生儿溶血病中的应用及操作程序注意事项等逐一介绍。一、 产前诊断 夫妇抗体效价的测定母婴不合导致新生溶血病的前提条件是母亲有针对胎儿的IgG型抗体。并且抗体的效价达到一定程度才可能发生新生儿溶血病。因此在产前测定母亲体内的IgG型抗体效价是预测胎儿是否发生新生儿溶血非常重要的产前诊断试验。母婴血型是否相容是测定夫妇抗体效价的先决条件，因采集胎儿血液标本非常困难，可取父亲的标本，确定ABO血型是否相容。在临床上母亲O型血，父亲A、B或者AB型血需要检测ABO抗体效价。A型或B型的母亲发生新生儿溶血病的几率非常小，在临床上基本不做产前检查。使用Biovue抗人球蛋白IgG 卡测定ABO抗体效价测定程序1、配制中和血清。取母亲血清和二巯基乙醇各200微升，充分混匀。 2、将中和血清置于37水浴30分钟，以充分破坏血清中的IgM类抗体。 3、取6支干净试管排于试管架上。 4、将第一管加入50微升中和血清和350微升Bilss液。 5、第26管中分别加入200微升Bilss液。 6、从第一管中吸出200微升的液体加入第二管，混匀，在从第二管吸出200微升加入第三管混匀，依次倍比稀释。 7、取Biovue Coombs（IgG）卡，撕去铝箔，在六管中个依次加入倍比稀释好的血清40微升和0.8的父亲红细胞悬浮液（用Bliss配制）50微升。 8、将加好样的Coombs放入Biovue孵育器中孵育1030分钟。 9、将孵育好的Coombs卡放入Biovue离心机中离心5分钟，（离心必须在加样后30分钟内进行） 10、从微柱正反两方面进行结果的判读。用BioVue做夫妇抗体效价的测定具有操作简便、重复性好、结果判读简单等优点，但由于柱凝集系统的灵敏程度较高，与经典的抗人球蛋白试验测定的结果不能完全符合，因此在AABB中不建议使用柱凝集系统做夫妇抗体效价：“Do not use enhancement techniques albu- min, polyethylene glycol, low- ionic- strength saline (LISS) or enzyme-treated red cells because falsely elevated titers may be obtained. Gel testing is not recommended.在李勇主编实用血液免疫学血型理论和实验技术也有相关的描述 “MGIA不能用于吸收放散试验，再如经常在临床常规应用的抗体效价检测中也不能应用微柱凝胶试验（倍比稀释血清）1。从理论上使用柱凝集系统进行抗体效价的测定是符合原理的。在一些国内的文献资料中，建议自己建立正常值，正常的滴度范围应该增加12个滴度。在微柱凝胶法检测1610例O 型血孕妇IgG抗体效价的研究一文中“通过长期临床实践及BioVue系统工作站应用经验,采用了1: 256作为临界值,当IgG抗A (B)效价1: 256时,即给予中药免疫抑制治疗,当效价为1: 128时,即给予密切关注,每四至六周后复查一次,如抗体效价快速上升或1: 256时,即给予治疗。较好地帮助临床早期诊断,早期治疗,有效地减少了HDN的发生,降低HDN的损害程度,保证优生优育”。2二、产后诊断 诊断是否已经发生可新生儿溶血病在新生儿溶血病的检验中除检查母子的血型是否相合外，诊断ABO新生儿溶血病最有力的证据是正式患儿红细胞被来自母亲的IgG抗A（B）抗体致敏，因此以下三个试验来确定是否发生新生儿溶血病。一、 患儿红细胞直接抗人球蛋白试验如果患儿红细胞已经被致敏，则直接抗人球蛋白试验应该为阳性的结果，但由于ABO新生儿的A（B）抗原量少，所以被结合的抗体亦很少，多数呈弱阳性的混合外观或阴性结果。如果使用敏感性高的柱凝集系统做直接抗人球蛋白试验可大大提高其阳性率。操作步骤如下：1、 取患儿血液，离心，洗涤，取压积红细胞用生理盐水配制成35的红细胞悬液。2、 在抗人球蛋白（IgG）卡上标注患儿的姓名或者编号，撕开卡上的铝箔。3、 将10微升35红细胞悬液加入到相应的孔中。4、 离心5分钟。5、 判断结果。二、由于直接抗人球蛋白试验的灵敏度相对较低，因此还需要做患儿红细胞的放散试验。放散试验是灵敏度最高的试验，为新生儿溶血病的确诊试验。操作步骤采集患儿的血液标本，按照所检抗体的不同，使用不同的方法的到放散液（具体操作见附件）。1. 取出试剂卡，检测前确保试剂卡及样品完全平衡至室温，将试剂卡贴有有黑色标签（条形码）的一侧面向操作者。在贴有条形码的一侧作样品标记2. 撕开试剂卡上的铝箔带，仅暴露试验所需使用的反应腔3. 将 50 L 0.8% A、B、O红细胞混悬液加入相应的反应腔中 。4. 向相应的反应腔中加入 40 L的放散液。5. 观察反应腔内的反应物是否混匀，如需要，轻弹微柱。6. 37 环境下孵育 10 - 30 分钟。7. 用Ortho BioVue离心机离心试剂卡。8. 实验结束后，立即从微柱的正反两面判读凝集和/或溶血结果。结果判读Ac Bc Oc 指示细胞 游离的抗A抗体 游离的抗B抗体 游离的抗A抗B或抗C抗体 O O 游离的ABO 以外抗体 无游离抗体三、游离抗体试验。游离试验是一个辅助诊断试验，如果试验呈阳性反应，不能诊断为新生儿溶血病。因为在血清出现游离的IgG型抗体，但是不能证明此IgG型抗体已经致敏新生儿的红细胞。1 取出试剂卡，使用前确保试剂卡完全平衡到室温。2 观察卡的反面液面高度，确保试剂液面高于玻璃珠水平面3mm左右，否则请勿使用；撕开试剂卡上的锡纸，撕开后的微柱请于1小时内进行下面操作。3 向每个反应柱内加入50ul BILSS液。4 再分别向反应柱内加入10ul 3%红细胞悬液A、B、O细胞。5 最后向反应柱内加入40 ul婴儿血清或血浆。注，加样时，枪头请勿微柱管壁。6 观察柱中的反应物各组分是否混匀，必要时轻弹几下微柱充分，使反应物混匀。7 37孵育10-30分钟。8 用Biovue离心机离心5分钟，离心必须在加样后30分钟内进行。9、从微柱正反两面判读并记录结果。 结果判读Ac Bc Oc 指示细胞 游离的抗A抗体 游离的抗B抗体 游离的抗A抗B或抗C抗体 O O 游离的ABO 以外抗体 无游离抗体附件：抗体释放试验操作程序：(三)抗体释放试验：热放散法：经盐水洗涤3次的压积红细胞等量盐水置试管中，将试管置56水浴中不停地振摇10分钟，取出后置于外套备有56温水离心机内，2000转/分离心5分钟，分离试管上层含有血红蛋白的盐水层即为放散液。三氯乙烯放散法：a .三氯乙烯0.5份 三氯甲烷0.5份B 50压积红细胞1份c混合，立即反复颠倒34次，溶液变成油滴状。d立即离心，分层：上层、放散液中层、膜层下层、三氯乙烯液；三氯甲烷液e取上层放散液入另一管，此即为含抗体的液体，可以做被检血清，备做实验用，实验时24滴液体加1滴36红细胞悬液，只能用于间接coombs。改良二甲苯放散法(ABO)以外抗体一份致敏压积红细胞1份盐水混匀，加4份二甲苯加塞颠倒混合1分钟。然后将试管置56水浴中振摇3分钟，去塞，3000转/分离心5分钟，形成三层：上层，二甲苯。中层，红细胞基质。底层，血红蛋白放散液。吸去上层的二甲苯，加2份三氯甲烷，加塞，猛力颠倒1分钟，去塞将试管3000转/分离心5分钟，这样底层的血红蛋白放散液转至顶层，中间层为细胞基质，底层为三氯甲烷，吸出放散液再离心一次。去除渣子，此放散液即可做抗体检查。乙醚释放抗体法（ABO以外抗体）取一份洗3次以后压积红细胞1份生理盐水2份乙醚，颠倒摇匀10分钟，然后以3000转/分，离心5分钟。离心后分成三层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是深红色的抗体释放液。用清洁吸管吸出释放液，再离心1次，去除杂质，将释放液置37水浴5分钟除去乙醚，即可做抗体鉴定。冻融释放抗体法：1、RBC洗6次，保留最后一次洗涤液，作对照。2、取10滴压积红细胞，加3滴盐水，混匀。3、塞住试管口，转动试管，使细胞悬液在试管内壁形成薄层。4、试管置水平位置30冷柜中快速冻10分钟。5、将试管放到37水浴箱里振摇，使RBC块速融