紫外荧光课件.ppt

2020 2 16 紫外及荧光光谱法 UltravioletAbsorptionSpectroscopy 2020 2 16 太阳极紫外辐射 2020 2 16 紫外吸收光谱与分子结构的关系 紫外 可见吸收光谱 概述 紫外分光光度计 紫外吸收光谱的应用 2020 2 16 通过研究物质分子对紫外光的吸收情况进行定性 定量和结构的方法分析 第一节概述 研究物质在紫外 可见光区的分子吸收光谱的分析方法称为紫外 可见分光光度法 紫外 可见分光光度法是利用某些物质的分子吸收200 800nm光谱区的辐射来进行分析测定的方法 这种分子吸收光谱产生于价电子和分子轨道上的电子在电子能级间的跃迁 广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定 2020 2 16 表3 1物质颜色和吸收光的关系 2020 2 16 在紫外和可见光区范围内 有机化合物的吸收带主要由 n n 及电荷迁移跃迁产生 无机化合物的吸收带主要由电荷迁移和配位场跃迁产生 各种跃迁情况如图所示 第二节紫外 可见吸收光谱 图3 1电子跃迁图 2020 2 16 其中 跃迁所需能量最大 n 及配位场跃迁所需能量最小 因此 它们的吸收带分别落在远紫外和可见光区 从图中纵坐标可知 及电荷迁移跃迁产生的谱带强度最大 n 跃迁产生的谱带强度次之 配位跃迁的谱带强度最小 一 有机化合物的紫外 可见吸收光谱 一 电子跃迁类型 l 跃迁它需要的能量较高 一般发生在真空紫外光区 饱和烃中的 C C 键属于这类跃迁 例如乙烷的最大吸收波长 max为135nm 2020 2 16 图3 2分子的电子能级和跃迁 2020 2 16 2 n 跃迁实现这类跃迁所需要的能量较高 其吸收光谱落于远紫外光区和近紫外光区 如CH3OH或CH3NH2的n 分别为183nm和213nm 3 跃迁它需要的能量低于 的跃迁 吸收峰一般处于近紫外光区 在200nm左右 其特征是摩尔吸光系数大 一般 max 104为强吸收带 如乙烯 蒸气 的最大吸收波长 max为162nm 4 n 跃迁这类跃迁发生在近紫外光区和可见光区 它是简单的生色团如羰基 硝基等中的孤对电子向反键轨道的跃迁 其特点是谱带强度弱 摩尔吸光系数小 通常小于100 属于禁阻跃迁 2020 2 16 5 电荷迁移跃迁所谓电荷迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时 电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁 因此 电荷迁移跃迁实质是一个内氧化 还原过程 而相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱 2020 2 16 二 常用术语 1 生色团从广义来说 所谓生色团 是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团 表3 2一些常见生色团的吸收特性 2020 2 16 3 红移和蓝移在有机化合物中 常常因取代基的变更或溶剂的改变 使其吸收带的最大吸收波长入max发生移动 向长波方向移动称为红移 向短波方向移动称为蓝移 2 助色团助色团是指带有非键电子对的基团 如一OH OR NHR 一SH 一Cl 一Br 一I等 它们本身不能吸收大于200nm的光 但是当它们与生色团相连时 会使生色团的吸收峰向长波方向移动 并且增加其吸收强度 2020 2 16 某些有机化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团 OH OR NH2 SH Cl Br SR NR2 之后 吸收峰的波长将向长波方向移动 这种效应称为红移效应 这种会使某化合物的最大吸收波长向长波方向移动的基团称为向红基团 在某些生色团如羰基的碳原子一端引入一些取代基之后 吸收峰的波长会向短波方向移动 这种效应称为蓝移 紫移 效应 这些会使某化合物的最大吸收波长向短波方向移动的基团 如 CH2 CH2CH3 OCOCH3 称为向蓝 紫 基团 2020 2 16 表3 3助色团在饱和化合物中的吸收峰 2020 2 16 三 吸收带 1 R吸收带R带是由化合物的n 跃迁产生的吸收带 它具有杂原子和双键的共轭基团 例如 C O NO NO2 N N C S等 其特点是 n 跃迁的能量最小 处于长波方向 一般 max在270nm以上 但跃迁几率小 吸收强度弱 一般 100L mol 1 cm 1 例如 CH3NO2 max 280nm max 22R带 2020 2 16 2 K吸收带K带是由共轭体系中 跃迁产生的吸收带 其特点是 吸收峰的波长比R带短 一般 max 200nm 但跃迁几率大 吸收峰强度大 一般 104L mol 1 cm 1 随着共轭体系的增长 电子云束缚更小 引起 跃迁需要的能量更小 K带吸收向长波方向移动 K吸收带是共轭分子的特征吸收带 借此可判断化合物中的共轭结构 这是紫外光谱中应用最多的吸收带 例如 丁二烯 max 217nm max 104巴豆醛 max 217 5nm max 1 5 104在芳香环上如有生色团取代时 也会出现K带 如 苯乙烯 max 248nm max 1 4 104苯甲醛 max 249nm max 1 1 104 2020 2 16 3 B吸收带B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键 跃迁而产生的吸收带 是芳香族 包括杂环芳香族 的主要特征吸收带 其特点是 在230 270nm呈现一宽峰 且具有精细结构 max 255nm max约200 属弱吸收 常用来识别芳香族化合物 但在极性溶剂中测定或苯环上有取代基时 精细结构消失 4 E吸收带E带也是芳香族化合物的特征吸收谱带 可以认为是苯环内三个乙烯基共轭发生的 跃迁所发生的 E带可分为E1和E2二个吸收带 E1带的吸收峰大约在180nm 104 E2带约在200nm 7000 都属强吸收 El带是观察不到的 当苯环上有生色团取代且与苯环共轭时 E2带常与K带合并 吸收峰向长波移动 例如苯乙酮为 2020 2 16 K带 max 240nm 13000B带 max 278nm 1100R带 max 319nm 50 图3 3苯乙酮的紫外吸收光谱溶剂正庚烷 图3 4苯蒸气的吸收曲线 250300350 4 3 2 K B R nm lg 2020 2 16 四 溶剂对紫外吸收光谱的影响 1 溶剂的极性对最大吸收波长的影响 一般来说 随着溶剂极性增大 跃迁吸收峰红移 n 跃迁吸收峰紫移 表3 4溶剂对亚异丙酮吸收带的影响 2020 2 16 2 对光谱精细结构和吸收强度的影响随着溶剂极性的增大 分子振动受到限制 精细结构就会逐渐消失 合并为一条宽而低的吸收带 在选择测定电子吸收光谱曲线的溶剂时 应注意如下几点 1 尽量选用低极性溶剂 2 能很好地溶解被测物 并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性 3 溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收 下表列出紫外 可见吸收光谱中常用的溶剂 以供选择时参考 2020 2 16 表3 5常用紫外 可见测定的溶剂 2020 2 16 二 无机化合物的紫外 可见吸收光谱产生无机化合物紫外 可见吸收光谱的电子跃迁形式 一般分为两大类 电荷迁移跃迁和配位场跃迁 一 电荷迁移跃迁无机配合物有电荷迁移跃迁产生的电荷迁移吸收光谱 在配合物的中心离子和配位体中 当一个电子由配体的轨道跃迁到与中心离子相关的轨道上时 可产生电荷迁移吸收光谱 2020 2 16 不少过渡金属离子与含生色团的试剂反应所生成的配合物以及许多水合无机离子 均可产生电荷迁移跃迁 此外 一些具有d10电子结构的过渡元素形成的卤化物及硫化物 如AgBr HgS等 也是由于这类跃迁而产生颜色 电荷迁移吸收光谱出现的波长位置 取决于电子给予体和电子接受体相应电子轨道的能量差 例如 SCN 电子亲和力比Cl 小 Fe3 SCN 络合物的最大吸收波长大于Fe3 Cl 络合物 前者在可见光区 后者在紫外区 2020 2 16 二 配位场跃迁配位场跃迁包括d d跃迁和f f跃迁 元素周期表中第四 五周期的过渡金属元素分别含有3d和4d轨道 镧系和锕系元素分别含有4f和5f轨道 在配体的存在下 过渡元素五个能量相等的d轨道和镧系元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道和f轨道 当它们的离子吸收光能后 低能态的d电子或f电子可以分别跃迁至高能态的d或f轨道 这两类跃迁分别称为d d跃迁和f f跃迁 由于这两类跃迁必须在配体的配位场作用下才可能发生 因此又称为配位场跃迁 2020 2 16 三 金属离子影响下的配位体 跃迁 配位体的配位场越强 d轨道分裂能就越大 吸收峰波长就越短 例如 H2O的配位场强度小于NH3的配位场强度 所以Cu2 的水合离子呈浅蓝色 吸收峰794nm处 而它的氨合离子呈深蓝色 吸收峰在663nm处 一些常见配位体配位场强弱顺序为 I Br Cl OH 2 42 2 SCN 吡啶 NH3 乙二胺 联吡啶 邻二氮菲 NO2 CN 吸收光度法所使用的显色剂绝大多数都含有生色团及助色团 其本身为有色化合物 当与金属离子配位时 作为配位体的显色剂 其共轭结构发生了变化 导致其吸收光谱蓝移或红移 2020 2 16 三 光谱吸收曲线 一 朗伯一比耳定律 朗伯一比耳定律是光吸收的基本定律 它指出 光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关 在光程上每等厚层介质吸收相同比例值的光 用数学式表达为 I I0 10 abc或lgI0 I abc其中a吸收系数 b液层厚度 c溶液浓度 吸光度A abc如果浓度c的单位是百分浓度 g 100mL b的单位用cm 则上式中的吸光系数用符号E1 1cm表示 称为比吸光系数 2020 2 16 二 光谱曲线的表示方法 将不同波长的单色光依次通过被分析的物质 分别测得不同波长下的吸光度或透光率 然后绘制吸收强度参数 波长曲线 即为物质的吸收光谱曲线 图3 5物质的吸收光谱曲线 2020 2 16 第三节紫外吸收光谱与分子结构的关系 一 各类有机化合物的紫外吸收光谱 一 饱和烃及其取代衍生物 1 饱和烃及其取代衍生物饱和烃类分子中只含有 键 因此只能产生 跃迁 即 电子从成键轨道 跃迁到反键轨道 饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm 已超出紫外 可见分光光度计的测量范围 2020 2 16 饱和烃的取代衍生物如卤代烃 其卤素原子上存在n电子 可产生n 的跃迁 n 的能量低于 例如 CH3Cl CH3Br和CH3I的n 跃迁分别出现在173 204和258nm处 这些数据说明氯 溴和碘原子引入甲烷后 其相应的吸收波长发生了红移 显示了助色团的助色作用 直接用烷烃和卤代烃的紫外吸收光谱分析这些化合物的实用价值不大 但是它们是测定紫外和可见吸收光谱的良好溶剂 2020 2 16 二 不饱和烃及共轭烯烃 在不饱和烃类分子中 除含有 键外 还含有 键 它们可以产生 和 两种跃迁 跃迁的能量小于 跃迁 例如 在乙烯分子中 跃迁最大吸收波长为180nm 在不饱和烃类分子中 当有两个以上的双键共轭时 随着共轭系统的延长 跃迁的吸收带将明显向长波方向移动 吸收强度也随之增强 在共轭体系中 跃迁产生的吸收带又称为K带 2020 2 16 三 羰基化合物羰基化合物含有 C O基团 C O基团主要可产生 n n 三个吸收带 n 吸收带又称R带 落于近紫外或紫外光区 醛 酮 羧酸及羧酸的衍生物 如酯 酰胺等 都含有羰基 由于醛酮这类物质与羧酸及羧酸的衍生物在结构上的差异 因此它们n 吸收带的光区稍有不同 羧酸及羧酸的衍生物虽然也有n 吸收带 但是 羧酸及羧酸的衍生物的羰基上的碳原子直接连结含有未共用电子对的助色团 如 OH Cl OR等 2020 2 16 四 芳香族化合物 苯有三个吸收带 它们都是由 跃迁引起的 E1带出现在180nm max 60 000 E2带出现在204nm max 8 000 B带出现在255nm max 200 在气态或非极性溶剂中 苯及其许多同系物的B谱带有许多的精细结构 这是由于振动跃迁在基态电子的跃迁上的叠加而引起的 在极性溶剂中 这些精细结构消失 当苯环上有取代基时 苯的三个特征谱带都会发生显著的变化 其中影响较大的是E2带和B谱带 由于这些助色团上的n电子与羰基双键的 电子产生n 共轭 导致 轨道的能级有所提高 但这种共轭作用并不能改变n轨道的能级 因此实现n 跃迁所需的能量变大 使n 吸收带蓝移至210nm左右 2020 2 16 表3 6苯及其衍生物的吸收光谱 2020 2 16 五 稠环芳烃及杂环化合物稠环芳烃 如萘 蒽 芘等 均显示苯的三个吸收带 但是与苯本身相比较 这三个吸收带均发生红移 且强度增加 随着苯环数目的增多 吸收波长红移越多 吸收强度也相应增加 当芳环上的 CH基团被氮原子取代后 则相应的氮杂环化合物 如吡啶 喹啉 的吸收光谱 与相应的碳化合物极为相似 即吡啶与苯相似 喹啉与萘相似 此外 由于引入含有n电子的N原子 这类杂环化合物还可能产生n 吸收带 2020 2 16 第四节紫外分光光度计 一 组成部件紫外 可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成 即光源 单色器 吸收池 检测器和信号指示系统 图3 6紫外分光光度计 2020 2 16 一 光源对光源的基本要求是应在仪器操作所需的光谱区域内能够发射连续辐射 有足够的辐射强度和良好的稳定性 而且辐射能量随波长的变化应尽可能小 分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类 热辐射光源用于可见光区 如钨丝灯和卤钨灯 气体放电光源用于紫外光区 如氢灯和氘灯 钨灯和碘钨灯可使用的范围在340 2500nm 这类光源的辐射能量与施加的外加电压有关 在可见光区 辐射的能量与工作电压4次方成正比 光电流与灯丝电压的n次方 n 1 成正比 因此必须严格控制灯丝电压 仪器必须配有稳压装置 2020 2 16 在近紫外区测定时常用氢灯和氘灯 它们可在160 375nm范围内产生连续光源 氘灯的灯管内充有氢的同位素氘 它是紫外光区应用最广泛的一种光源 其光谱分布与氢灯类似 但光强度比相同功率的氢灯要大3 5倍 二 单色器单色器是能从光源辐射的复合光中分出单色光的光学装置 其主要功能 产生光谱纯度高的波长且波长在紫外可见区域内任意可调 单色器一般由入射狭缝 准光器 透镜或凹面反射镜使入射光成平行光 色散元件 聚焦元件和出射狭缝等几部分组成 其核心部分是色散元件 起分光的作用 单色器的性能直接影响入射光的单色性 从而也影响到测定的灵敏度 选择性及校准曲线的线性关系等 能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅 2020 2 16 棱镜有玻璃和石英两种材料 它们的色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开 由于玻璃可吸收紫外光 所以玻璃棱镜只能用于350 3200nm的波长范围 即只能用于可见光域内 石英棱镜可使用的波长范围较宽 可从185 4000nm 即可用于紫外 可见和近红外三个光域 光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的 它可用于紫外 可见及红外光域 而且在整个波长区具有良好的 几乎均匀一致的分辨能力 它具有色散波长范围宽 分辨本领高 成本低 便于保存和易于制备等优点 缺点是各级光谱会重叠而产生干扰 2020 2 16 入射 出射狭缝 透镜及准光镜等光学元件中狭缝在决定单色器性能上起重要作用 狭缝的大小直接影响单色光纯度 但过小的狭缝又会减弱光强 三 吸收池吸收池用于盛放分析试样 一般有石英和玻璃材料两种 石英池适用于可见光区及紫外光区 玻璃吸收池只能用于可见光区 为减少光的损失 吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向 在高精度的分析测定中 紫外区尤其重要 吸收池要挑选配对 因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响 2020 2 16 四 检测器检测器的功能是检测信号 测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置 常用的检测器有光电池 光电管和光电倍增管等 硒光电池对光的敏感范围为300 800nm 其中又以500 600nm最为灵敏 这种光电池的特点是能产生可直接推动微安表或检流计的光电流 但由于容易出现疲劳效应而只能用于低档的分光光度计中 光电管在紫外 可见分光光度计上应用较为广泛 光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件 它的灵敏度比一般的光电管要高200倍 因此可使用较窄的单色器狭缝 从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力 2020 2 16 五 信号指示系统它的作用是放大信号并以适当方式指示或记录下来 常用的信号指示装置有直读检流计 电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等 很多型号的分光光度计装配有微处理机 一方面可对分光光度计进行操作控制 另一方面可进行数据处理 2020 2 16 二 紫外 可见分光光度计的类型紫外 可见分光光度计的类型很多 但可归纳为三种类型 即单光束分光光度计 双光束分光光度计和双波长分光光度计 1 单光束分光光度计经单色器分光后的一束平行光 轮流通过参比溶液和样品溶液 以进行吸光度的测定 这种简易型分光光度计结构简单 操作方便 维修容易 适用于常规分析 2 双光束分光光度计经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光 一束通过参比池 一束通过样品池 2020 2 16 光度计能自动比较两束光的强度 此比值即为试样的透射比 经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来 双光束分光光度计一般都能自动记录吸收光谱曲线 由于两束光同时分别通过参比池和样品池 还能自动消除光源强度变化所引起的误差 3 双波长分光光度计由同一光源发出的光被分成两束 分别经过两个单色器 得到两束不同波长 1和 2 的单色光 利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池 然后 2020 2 16 经过光电倍增管和电子控制系统 最后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值 A A A 1 A 2 对于多组分混合物 混浊试样 如生物组织液 分析 以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下 利用双波长分光光度法 往往能提高方法的灵敏度和选择性 利用双波长分光光度计 能获得导数光谱 通过光学系统转换 使双波长分光光度计能很方便地转化为单波长工作方式 如果能在 1和 2处分别记录吸光度随时间变化的曲线 还能进行化学反应动力学研究 2020 2 16 2020 2 16 图3 7双波长分光光度计原理图 2020 2 16 三 分光光度计的校正通常在实验室工作中 验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行波长校正和吸光度校正 建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正 镨铷玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰 可用来校正分光光度计的波长标尺 前者用于可见光区 后者则对紫外和可见光区都适用 也可用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度 2020 2 16 第五节紫外吸收光谱的应用 一紫外吸收光谱法在有机定性分析中的应用紫外吸收光谱最主要的应用是在有机化合物的定性 定量分析方面 例如化合物的鉴定 结构分析和纯度检查等 在药物 天然化合物中应用较多 一 化合物的鉴定有机化合物的鉴定 一般采用光谱比较法 即将外知纯化合物的吸收光谱特征 如吸收峰的数目 位置 相对强度以及吸收峰的形状 极大 极小和拐点 与已知纯化合物的吸收光谱进行比较 为了便于比较 吸收光谱常以lgA对 作图 此时朗伯 比尔定律可写成lgA lgk lgbc 2020 2 16 式右边只有k随波长变化 因此 即使浓度c和吸收池厚度b不同 也只使吸收曲线上下移动 并不影响形状 若未知化合物和纯已知化合物的吸收光谱非常一致 则可认为就是同一种化合物 但是 由于大多数有机化合物的紫外 可见光谱比较简单 谱带宽且缺乏精细结构 特征性不明显 而且很多生色团的吸收峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响 因此 仅依靠紫外光谱数据来鉴定未知化合物具有较大的局限性 必须与其他方法如红外光谱法 核磁共振波谱法等相配合 才能对未知化合物进行准确的鉴定 二 结构分析紫外吸收光谱虽然不能对一种化合物作出准确鉴定 但对化合物中官能团和共轭体系的推测与确定却是非常有效的 一般有以下规律 2020 2 16 1 在220 280nm范围内无吸收 可推断化合物不含苯环 共轭双键 醛基 酮基 溴和碘 饱和脂肪族溴化物在220 210nm有吸收 2 在210 250nm有强吸收 表示含有共轭双键 如在260nm 300nm 330nm左右有高强度吸收峰 则化合物含有3 5个共轭 键 3 在270 300nm区域内存在一个随溶剂极性增大而向短波方向移动的弱吸收带 表明有羟基存在 4 在约260nm处有具有振动精细结构的弱吸收带则说明有苯环存在 5 如化合物有许多吸收峰 甚至延伸到可见光区 则可能为多环芳烃 2020 2 16 紫外 可见吸收光谱也可以用来作同分异构体的判别 例如 下面两种化和物 用化学方法只能测出它们各含有两个羰基 但二者的紫外光谱却有很大差别 化合物 在270nm处有最大吸收 吸收峰位置与丙酮相同而强度差不多是丙酮的两倍 化合物 由于两个碳氧双键共轭 吸收峰出现在400nm左右 2020 2 16 再如 乙酰乙酸乙酯存在下述酮 烯醇互变异构体 酮式烯醇式酮式没有共轭双键 它在204nm处仅有弱吸收 而烯醇式由于有共轭双键 因此在245nm处有强的K吸收带 18000L mol 1cm 1 2020 2 16 例如 在顺式肉桂酸和反式肉桂酸中 顺式空间位阻大 苯环与侧链双键共平面性差 不易产生共轭 反式空间位阻小 双键与苯环在同一平面上 容易产生共轭 因此 反式的最大吸收波长 max 295nm max 7000 而顺式的最大吸收波长 max 280nm max 13500 采用紫外光谱法 还可以测定某些化合物的互变异构现象 例如 乙酰乙酸乙酯有酮式和烯醇式间的互变异构 2020 2 16 图3 10酮式与水形成分子间氢键烯醇式形成分子内氢键 2020 2 16 在极性溶剂中 最大吸收波长 max 272nm max 16 说明该峰由n 跃迁引起 所以在极性溶剂中 该化合物应以酮式存在 相反 在非极性的正己烷中 出现 max 243nm的强峰 这说明在非极性溶剂中 形成了分子内氢键 故是以烯醇式为主 2020 2 16 二 定量分析 用已知的标准样品配制成一系列不同浓度的溶液 在一定的实验条件和合适的波长下 分别测定其吸光度 然后以吸光度相对于物质的浓度作图 得一吸光度与浓度的校正曲线图 理想的校正曲线应为通过原点的直线 利用该线性关系 就能求得待测组份中该物质的含量 2020 2 16 一 解联立方程组的方法 图3 11吸光度与浓度的校正曲线图 2020 2 16 二 双波长分光光度法 1 等吸收波长法当混合组份的吸收曲线是如图所示的情况时 除用解二元一次方程组的方法测定外 还可采用等吸收波长法 为了消除干扰组份的吸收 一般采用作图法确定干扰组份的等吸收波长 图中是混合试样中A B两组份的吸收曲线 其中A是干扰组份 B是待测组份 在用作图法选择波长时 可将测定波长 2选在被测组份B的吸收峰处 或其附近 而参比波长 1的选择 应考虑能消除干扰物质的吸收 即使A组份在 1的吸光度等于它在 2的吸光度 A 1 A 2 2020 2 16 根据吸光度的加和原则 混合物在 1和 2处的吸光度分别为 A 1 AA 1 AB 1A 2 AA 2 AB 2 A A 2 A 1 1 2 A B A 图3 12A B吸收曲线 2020 2 16 双波长分光光度计的输出信号是 A AA 2 AB 2 AA 1 AB 1由于双波长分光光度计使用同一光源 即 1及 2强度相等 根据AA 2 AA 1 所以 A AA 2 AB 2 AA 1 AB 1 AB 2 AB 1输出信号 A与干扰组份无关 它正比于B组份的浓度c 这样就消除了干扰组份的影响 2020 2 16 2 系数倍率法当干扰组份A不存在吸光度相等的两个波长时 采用上述方法不能测量B组份的含量 如图所示 此时 可采用系数倍率法测定 设A组份在 1和 2的吸光度分别为AA 1和AA 2 则倍率系数K AA 2 AA 1 若使用倍率系数仪将AA 1的值扩大K倍 则有KAA 1 AA 2 此时 KAA 1 AA 2 0 与等吸收波长法类似 A组份的干扰被消除 这种方法也可以用于测定含有三种组份的混合样品 2020 2 16 图3 13吸收曲线 A B B A 2020 2 16 3 双波长法测定混浊样品在用双光束法测定混浊样品时 由于参比溶剂不像样品那样混浊 因此测量时不能消除样品混浊产生的背景吸收 在双波长法测定中 若将 2设在样品的吸收峰上 1设在样品无特征吸收的波长上 此时 1和 2处的背景吸收应相等 显然 2上测得的是样品本身的吸收与背景吸收的总和 1测得的是背景吸收 因此 用双波长法可以消除样品混浊产生的背景吸收 由于消除背景后的样品吸收与其浓度成正比 因此可对样品进行定量分析 2020 2 16 三 导数分光光度法 1 能够分辨两个或两个以上完全重叠或以很小波长差相重叠的吸收峰 当两个峰的峰高与半宽度的比值不相同时 则可认为它们的尖锐程度不同 图中两个尖锐程度不同的吸收峰1和峰2在同一波长处相互重叠 叠加成吸收峰3 从吸收峰3的外形 很难辨别出它是由两个吸收峰叠加而成的 如果将其透光率曲线4进行一次求导 就得到如曲线5所示的导数光谱线 在曲线的正负两个方向上 各出现两个导数光谱峰 从而很容易地辨认出来 2020 2 16 图3 14导数光谱 从透光率求得 2020 2 16 2 能够分辨吸光度随波长急剧上升时所掩盖的弱的吸收峰 通常 当一个弱峰处于强峰的吸光度急剧上升处时 检出很困难 而导数光谱能提高分辨能力 一般经过数次求导后 有可能分辨出叠加在强峰肩部的弱峰 3 能够确认宽阔吸收带的最大吸收波长 2020 2 16 紫外光谱在高分子中的应用 1 聚合物老化性能研究2 共聚物中有紫外吸收嵌段含量的确定3 吸附分离材料中芳香成分的确定4 聚合物结构的确定5 紫外自修复材料 2020 2 16 2020 2 16 分子发光 荧光 磷光光谱法MolecularfluorescenceMolecularphosphorescence 2020 2 16 简介 分子发光属于发射光谱范畴 包括分子荧光 分子磷光和化学发光 分子荧光和分子磷光属于光致发光 但是荧光发射 在电子能量变化中不涉及电子自旋的改变 荧光的寿命较短 为10 5s 磷光发射 在电子能量变化中伴随电子自旋的改变 磷光的寿命较长 为为几秒 甚至更长 化学发光基于在化学反应过程中 生成了能产生发射光谱的激发态物质 产生的光谱不一定是被分析物本身的光谱 而往往是被分析物反应生成物质的光谱 有时被分析物作为抑制剂或催化剂 2020 2 16 第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N Monardes 他于1575年提到 在含有一种称为 LignumNephriticum 的木头切片的水溶液中 呈现可爱的蓝色 以后逐步有一些学者也观察和描述过荧光现象 但对其本质及含义的认识都没有明显的进展 直到1852年 对荧光分析法具有开拓性工作的Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时 用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长些 而不是由光的漫反射引起的 从而导入荧光是光发射的概念 并提出了 荧光 这一术语 他还研究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系 并描述了在高浓度或某些外来物质有在时的荧光猝灭现象 可以说 他是第一个提出应用荧光作为分析手段的人 1867年 Goppelsrode应用铝一桑色素色素配位化合物的荧光测定铝 这是历史上首次进行的荧光分析工作 2020 2 16 磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光 1944年Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念 指出磷光是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光 磷光分析法由于其有某些特点 几十年来的理论研究及应用也不断得到发展 进入二十世纪以后 荧光现象被研究得更多了 在理论或实验技术上都得到极大的发展 特别是随着激光 计算机和电子学的新成就及技术的引入 大大推动了荧光分析法在理论上及实验技术的发展 出现了许多新的理论和新的方法 2020 2 16 2008年诺贝尔化学奖由日本科学家下村修 美国科学家马丁 沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健获得 是因为他们发现和研究绿色荧光蛋白 GFP 方面做出重大贡献 将平分诺贝尔化学奖1000万瑞典克朗 约合140万美元 2020 2 16 11 1分子荧光和磷光光谱法1 产生机理在一般温度下 大多数分子处在基态的最低振动能级 处于基态的分子吸收能量 电能 热能 化学能或光能等到 后天激发为激发态 激发态是很不稳定的 它得很快地释放出能量又重新跃迁回基态 若分子返回基态时以发射的电磁辐射 即光 的形式释放能量 就称为 发光 如果物质的分子吸收了光能而被激发 跃迁回基态所发射的电磁辐射 称为荧光和磷光 现从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理 2020 2 16 2020 2 16 无辐射跃迁 振动弛豫 激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程 其效率较高 内转换 相同多重态的两个电子能级间 电子由高能级回到低能级的分子内过程 系间窜越 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程 外转换 激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用 能量转换而使荧光 或磷光 减弱甚至消失的过程 荧光强度的减弱或消失 称为荧光熄灭 或猝灭 2020 2 16 分子荧光 磷光分光光度法 是一种发射光谱法 其分析过程是 用一定波长的光 激发光 照射试样溶液 试样溶液中吸收光子的分子 激发态分子 发射相同或较长波长的光 荧光 若约经过10 6秒或更长的时间 发射更长波长的光 磷光 处于分子基态单重态的分子轨道上的电子是配对的 而且自旋相反 当其中的一个电子被激发 跃迁至第一激发态单重态 或更高激发单重态 电子自旋方向不变 通过内部转换回到第一激发态的最低振动能级 发射光子回基态 产生荧光 2020 2 16 处于分子基态单重态的分子轨道上的电子 激发时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上 不符合光谱选择定则 但处于单重激发态的轨道上的电子 可以通过体系跨越 系间窜跃 转移到三重态轨道上 在这个过程中 处于激发态的电子自旋发生变化 这个过程需要时间较长 故处于三重激发态的寿命为10 4 1s 当其由三重激发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光 单重态分子是抗磁性的 三重态分子是顺磁性的 2020 2 16 2020 2 16 2 荧光光谱的特点 荧光光谱的形状与激发光的波长无关 因为荧光总是从第一激发态的最低振动能级发射的 荧光光谱的形状与激发光谱的形状十分相似 互为镜像 镜面对称 一般说来 荧光的波长比激发光谱波长长 荧光大多数是 跃迁产生的 几乎所有荧光体系都含有一个以上的芳香基团 此外作为荧光显色剂还含有两个成络基团 一般说来 大多数荧光物质都是含有 键或n电子的物质 2020 2 16 3 荧光强度 If I0 bc Kc定量关系式 2020 2 16 量子化效率 荧光的量子化效率 与过程中速度常数有关 且为 2020 2 16 4 荧光 磷光与化学结构的关系 具有刚性结构和平面结构的 电子共轭体系 随 电子共轭度和分子平面度的增大 荧光量子化效率增大 荧光光谱向长波方向移动 ph CH CH 3ph ph CH CH 2ph的荧光量子化效率分别为0 68和0 28 荧光物质的刚性和共平面性的增加 减小了荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用 使外转移的能量减小 有利于荧光 芴与联二苯的荧光效率分别为1 0和0 2 芳香化合物上的取代基会使该化合物的最大吸收波长和荧光峰改变 不同取代基的作用不同 卤素取代随卤原子的序数增加 荧光下降 磷光增强 这是所谓的重原子效应 改变了自旋轨道的相互作用 增加了由单重激发态向三重激发态转变的速度 2020 2 16 5 影响光致发光的因素 1 溶剂的影响随着溶剂介电常数 极性 的增大 荧光峰的波长增长 荧光效率增大 含有重原子的溶剂 有重原子效应 使荧光减弱 磷光增强 溶剂中的杂质荧光光谱或溶剂的拉曼光谱干扰测定 或选用高分辨率的仪器 或对溶剂进行空白测定给予校正 2020 2 16 2 温度影响一般说来 大多数荧光物质都随其溶液的温度升高荧光效率降低 因此 荧光和磷光分析常在低温下进行 特别是磷光的测定 3 pH的影响当荧光物质为弱酸或弱碱时 溶液的pH值强烈地影响其荧光强度和荧光光谱的形状和发射波长 这里关键是分子状态还是离子状态有荧光 4 荧光的熄灭荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象 称为荧光熄灭 使荧光熄灭的因素很多 碰撞熄灭 能量转移 氧的熄灭作用 自熄灭和自吸收 2020 2 16 荧光和磷光均属于光致发光 所以都涉用到两种辐射 即激发光 吸收 和发射光 因而也都具有两种特征光谱 即激发光谱和发射光谱 激发光谱 是通过扫描激发单色器 使不同波长的入射光照射荧光 磷光 体 对其所发出的荧光 磷光 通过固定波长的发射单色器 照射到检测器上 检测其荧光 磷光 强度 由此得到光强度对激发光波长的关系曲线 发射光谱 也称荧光光谱或磷光光谱 是固定激光发光的波长 扫描发射的光的波长 记录发射光强度对发射光波长的关系曲线 即为发射光谱 通过发射光谱选择最佳的发射波长 发射荧光 磷光 强度最大的发射波长 常用 em表示 磷光发射波长比荧光来得长 6 激发光谱与荧光 磷光 光谱 2020 2 16 激发光谱与荧光 磷光光谱互成镜象对称 如菲的激发光谱 荧光 磷光光谱 2020 2 16 2020 2 16 荧光激发光谱和发射光谱的特征 1 斯托克斯位移 在溶液荧光光谱中 所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长 Stokes于1852年首次发现这种波长位移现象 故称Stokes位移 斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存大着一定的能量损失 激发态分子由于振动弛豫及内都转移的无辐射跃迁而迅速衰变到S1电子态的最低振动能级 这是产生其位移的主要原因 其次 荧光发射时 激发态的分子衰变到基态的各振动能级 此时 不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级 也造成能量的损失 第三 溶剂效应和激发态分子可能发生的某些反应 也会加大斯托克斯位移 2 荧光发射光谱的形状与激发波长无关 由于荧光发射是激发态的分子由第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的 所以不管激发光的能量多大 能把电子激发到种激发态 都将经过司迅速的振动弛豫及内部转移跃迁至第一激发单重态的最低能级 然后发射荧光 2020 2 16 3 荧光激发光谱的形状与发射波长无关 由于在稀溶液中 荧光发射的效率 称为量子产率 与激发光的波长无关 因此用不同发射波长绘制激发光谱时 激发光谱的形状不变 只是发射强度不同而已 4 荧光激发光谱与吸收光谱的形状相近似 荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系 物质的分子只有对光有吸收 才会被激发 所以 从理论上说 某化合物的荧光激发光谱的形状 应与它的吸收光谱的形状完全相同 然而实际并非如此 由于存在着测量仪器的因素或测量环境的某些影响 使得绝大多数情况下 表观 激发光谱与吸收光谱两者的形状有所差别 为什么两种光谱会互为镜像关系呢 吸收光谱中的第一吸收带是由于基态分子吸收光能量被激发到第一电子激发态的各不同振动能级 所以 其形状取决于第一电子激发态中各振动能级的分布情况 即能量间隔情况 而荧光光谱是激发态分子从第一电子激发单重态的最低振动能级跃回基态中的各不同振动能级所致 所以荧光光谱的形状取决于基态中各振动能级的分布情况 一般情况下 基态和第一电了激发单重态中振动能级的分布情况是相同的 所以荧光发射光谱与吸收光谱的形状是类似的 2020 2 16 发射荧光的有机化合物通常具有以下的结构特征 1 具有 电子跃迁类型的结构 实验表明 大多数能发荧光的化合物都是由 或n 跃迁激发 然后经过振动弛豫等无辐射跃迁 再发生 或 n跃迁而产生荧光 2 具有大的共轭 键结构 发生荧光 或磷光 的物质 其分子都含有共键双键 键 的结构体系 共轭体系越大 电子的离域性越大 越容易被激发 荧光也就越容易发生 且荧光光谱向长波移动 大部分荧光物质都具有芳环或杂环 芳环越大 其荧光 或磷光 峰越向长波移动 且荧光强度往往也较强 3 具在刚性平面结构 实验发现 多数具有性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光 因为这种结构可为减少分子的振动 使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少 即可减少能量外部转移的损失 有利于荧光的发射 而且平面平面结构可以增大分子的吸光截面 增大摩尔吸光系数 增强荧光强度 例如 2020 2 16 2020 2 16 4 取代基的影响 取代基的性质 尤其是发色基因 对荧光体与的荧光特性和强度均有强烈的影响 芳烃及杂环化合物的荧光激发光谱 发射光谱及荧光效率常随取代基的不同而异 由于目前对于激发态分子的性质了解还很不够 尚不能真正从机制上揭开其影响的秘密 其影响规律多出自实验总结和推测 给电子取代基使荧光加强属于这类基团的有 NH2 NHR NR2 OH OR CN等 由于这些基团上的n电子云几乎与芳环上的 电子轨道平行 因而实际上它们共享了共轭 电子 形成了p 共轭 扩大共轭体系 吸电子基团使荧光减弱而磷光增强属于这类基团的有如羰基 COOH CHO 硝基 NO2 及重氮基 NH N N 等 这类基团都会发生跃迁 属于禁阻跃迁 所以摩尔吸光系数小 荧光发射也弱 而系间跨跃较为强烈 同样使荧光减弱 相应磷光增强 取代基位置的影响取代基位置对芳烃荧光的影响通常为 邻位 对位取代者增荧光 间位取代者抑制荧光 CN取代者例外 取代基的空间阻碍对荧光也有明显的影响 例如 2020 2 16 2020 2 16 无机物的荧光无机化合物的荧光有无机盐类的荧光和金属螯合物的荧光两种 某些无机盐类的荧光 无机化合物本身能发荧光 或磷光 的不多 常见的主要有镧系元素 的化合物 U 化合物 类汞离子化合物Tl Sn P As Sb Bi Se 等 这些化合物在低温 液氮 下都有较高的荧光效率和选择性 因此常用低温荧光法进行测定 金属螯合物的荧光 无机离子与具有吸光结构的有机试剂发生配合作用 生成会发荧光的螯合物 可以进行荧光测定 这种能发荧光的螯合物可能是螯合物中配位体的发光 也可能是螯合物中金属离子的发光 螯合物中配位体的发光 这一类螯合物中金属离子的外电子层具有与惰性气体相同的结构 为抗磁性的离子 它与含有芳基的有机配位体形成螯合物时多数会发射较强的荧光 这是因为原来的配们体虽有吸收光构型 但其最低激发单重态的S1是n 型 及缺乏刚性平面结构 所以并不发荧光 而与金属离子配合后 配位体变为最低激发单重态的 型 且由于螯合物的形成 而具有则性平面结构 因此能发射荧光 如下列例子所示 2020 2 16 2020 2 16 螯合物中金属离子的荧光 这些金属离子的次外层中具有未完满电子的d轨道或f轨道 它们吸收光时 会发生d d 或f f 的吸收跃迁 也会发生d d或f f的发光跃迁 但跃迁机率很小 吸光及发光很弱 当与配位体螯合时 则首先是发生配位体的 吸收跃迁 而通过金属离子的d 或f 能层在配位体激发后最低激发单重态S1能层的下方 因而可以发生能量的转移 由S1转移给d 或f 然后发生d d或f f或跃迁 使跃迁机率增大 发光强度增大 2020 2 16 7 荧光和磷光分析仪器 2020 2 16 1 激发光源激发光源应具有足够的强度 适用波长范围宽 稳定等特点 常用的光源有高压汞灯和氙弧灯 高压汞灯 高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源 主要有365 405 436nm的三条谱线 尤以365nm谱线最强 一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源 氙弧灯 氙弧灯通常就叫氙灯 是目前荧光分光分度计中应用最广泛的一种光源 它是一种电弧气体放电灯 外套为石英 内充氙气 温度时其压力为5atm 工作时压力为20atm 具有光强度大 在200 800nm范围内是连续光源的特点 2 单色器荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色器 称为荧光分光光度计 光栅有两块 第一块为激发单色器 用于选择激发光的波长 第二块为发射单色器 用于选择荧光发射波长 在比较低档次的荧光计中 采用滤光片作为单色器 第一滤光片用的分离出所需用的激发光 第二滤光片用以滤支杂散光 瑞利光 拉曼光和杂质所发射的荧光 2020 2 16 3 样品池荧光分析的样品池通常用石英材料做成 它与吸光分析法的液池不同在于 荧光样品池的四面均为磨光透明面 同时一般仅有厚度为1cm的池 4 检测器简易型的荧光计可用目视检测 或用硒光电池 光电管检测 现在的荧光计多采用光电倍增管进行检测 检测器的方向应与激发光的方向成直角 以消除样品池中透射光和杂散光的于扰 在现代的高级仪器中 光导摄象管用来作为光学多道分析器的检测器 它具有检测效率高 动态范围宽 线性响应好 坚固耐用和寿命长等优点 它的检测灵敏敏显不职光电倍增管 但却能同时接受荧光体的整个发射光谱 5 记录 显示装置荧光仪的读出装置有读字电压表或记录仪 现代仪器都配上计算机 进行自动控制和显示荧光光谱及各种参数 2020 2 16 磷光分析仪与荧光分析仪的差别磷光分