第10章DNA的生物合成.ppt

分子生物学 中心法则 第10章 DNA的生物合成DNABiosynthesis Replication 复制 replication 是指遗传物质的传代 以母链DNA为模板合成子链DNA的过程 复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication 第一节 半保留复制 semi conservativereplication 半不连续复制 semi discontinuousreplication 双向复制 bidirectionalreplication 复制的基本规律 一 半保留复制是DNA复制的基本特征 DNA生物合成时 母链DNA解开为两股单链 各自作为模板 template 按碱基配对规律 合成与模板互补的子链 子代细胞的DNA 一股单链从亲代完整地接受过来 另一股单链则完全重新合成 两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致 这种复制方式称为半保留复制 半保留复制的概念 密度梯度实验 实验结果支持半保留复制的设想 含重氮 DNA的细菌 14N标记的核苷酸 第二代 梯度离心结果 15N 14N 15N 按半保留复制方式 子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致 即子代保留了亲代的全部遗传信息 体现了遗传的保守性 半保留复制的意义 遗传的保守性 是物种稳定性的分子基础 但不是绝对的 AGGTACTGCCACTGG TCCATGACGGTGACC CCACTGG GGTGACC AGGTACTG TCCATGAC TCCATGAC AGGTACTG AGGTACTGCCACTGG TCCATGACGGTGACC AGGTACTGCCACTGG TCCATGACGGTGACC 母链DNA 复制过程中形成的复制叉 子代DNA 二 DNA的半不连续复制 领头链 leadingstrand 随从链 laggingstrand DNA的半不连续复制 冈崎片段 顺着解链方向生成的子链 复制是连续进行的 这股链称为领头链 leadingstrand 另一股链因为复制的方向与解链方向相反 不能顺着解链方向连续延长 这股不连续复制的链称为随从链 laggingstrand 复制中的不连续片段称为岡崎片段 okazakifragment 领头链连续复制而随从链不连续复制 就是复制的半不连续性 原核生物复制时 DNA从起始点 origin 向两个方向解链 形成两个延伸方向相反的复制叉 称为双向复制 三 DNA复制的双向性 A 环状双链DNA及复制起始点B 复制中的两个复制叉C 复制接近终止点 termination ter 真核生物每个染色体有多个起始点 是多复制子的复制 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子 replicon 复制子是独立完成复制的功能单位 参与DNA复制的原料和酶 第二节 TheMaterialsandEnzymeofDNAReplication 参与DNA复制的原料物质 底物 substrate dATP dGTP dCTP dTTP 模板 template 解开成单链的DNA母链 引物 primer 提供3 OH末端使dNTP依次聚合聚合酶 polymerase 依赖DNA的DNA聚合酶 简写为DNA pol其他的酶和蛋白质因子 一般原料 酶 一 DNA聚合酶 全称 依赖DNA的DNA聚合酶 DNA dependentDNApolymerase 简称 DNA pol 活性 1 5 3 的聚合活性2 核酸外切酶活性 一 DNA聚合酶催化核苷酸之间生成3 5 磷酸二酯键 dNMP n dNTP dNMP n 1 PPi 3 5 磷酸二酯键 聚合反应的特点 DNA pol催化3 5 磷酸二酯键的生成新链的延长只可沿5 3 方向进行 DNA新链生成需引物和模板 3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性 能切除突变的DNA片段 能辨认错配的碱基对 并将其水解 核酸外切酶活性 一 原核生物的DNA聚合酶分为三型 DNA pol DNA pol DNA pol 功能 DNA pol 109kD 对复制中的错误进行校读 对复制和修复中出现的空隙进行填补 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段 Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 N端 C端 DNA pol Klenow片段是实验室合成DNA 进行分子生物学研究中常用的工具酶 DNA pol 120kD DNA polII基因发生突变 细菌依然能存活 DNA pol 对模板的特异性不高 即使在已发生损伤的DNA模板上 它也能催化核苷酸聚合 因此认为 它参与DNA损伤的应急状态修复 功能 DNA pol 250kD 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶 原核生物的DNA聚合酶 5 催化复制合成 应急修复 主要作用 多亚基不对称 二聚体 单肽链 组成 250 120 109 分子量 kD DNA pol III DNA pol II DNA pol I 3 参与校对 修复 多亚基不对称 二聚体 单肽链 组成 250 120 109 分子量 kD DNA pol III DNA pol II DNA pol I 二 常见的真核细胞DNA聚合酶有五种 DNA pol 起始引发 有引物酶活性 延长子链的主要酶 有解螺旋酶活性 参与低保真度的复制 在复制过程中起校读 修复和填补缺口的作用 在线粒体DNA复制中起催化作用 DNA pol DNA pol DNA pol DNA pol 真核生物的DNA聚合酶 四 同DNA分子解链相关的酶 1 解螺旋酶 helicase 利用ATP供能 作用于氢键使DNA双链解开成为两条单链 运送和协同 DnaB DnaC 解开 DNA 双链 解螺旋酶 DnaB 辨认起始点 DnaA 蛋白质 通用名 功能 3 5 3 5 解螺旋酶的作用 ori 2 单链DNA结合蛋白 singlestrandedDNAbindingprotein SSB 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 DnaA DnaB DnaC 3 5 3 5 dATP dCTP dGTP 3 DNA拓扑异构酶 复制过程正超螺旋的形成 解链过程中正超螺旋的形成 既能水解 又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶 拓扑异构酶 拓扑异构酶分类 拓扑异构酶作用特点 拓扑异构酶 切断DNA双链中一股链 使DNA解链旋转不致打结 适当时候封闭切口 DNA变为松弛状态 反应不需ATP 拓扑异构酶I作用机制 拓扑异构酶II作用机制 拓扑酶II的作用方式 拓扑酶II的作用方式 拓扑异构酶 五 DNA连接酶 连接DNA链3 OH末端和相邻DNA链5 P末端 使二者生成磷酸二酯键 从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链 DNA连接酶 DNAligase 作用方式 HO 5 3 3 5 DNA连接酶 ATP ADP 5 3 5 3 DNA连接酶的作用 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用 在DNA修复 重组及剪接中也起缝合缺口作用 也是基因工程的重要工具酶之一 功能 DNA聚合酶 拓扑酶和连接酶催化3 5 磷酸二酯键生成的比较 DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication 第三节 一 复制起始 DNA解链形成引发体 准备工作 1 DNA解开成单链 提供模板 2 形成引发体 合成引物 提供3 OH末端 一 原核生物的DNA生物合成 E coli复制起始点oriC 1 DNA解链 DnaA DnaB DnaC DNA拓扑异构酶 引物酶 SSB 3 5 3 5 2 引发体和引物 含有解螺旋酶 DnaC蛋白 引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子 引物 引物酶 二 复制的延长 复制的延长指在DNA pol催化下 dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成 dATP dGTP dTTP dCTP dTTP dGTP dATP dCTP OH3 3 领头链的合成 领头链的子链沿着5 3 方向可以连续地延长 随从链的合成 复制过程简图 领头链和随从链由相同的DNA pol催化延长 阶段一 阶段二 阶段三 阶段四 原核生物基因是环状DNA 双向复制的复制片段在复制的终止点 ter 处汇合 三 复制的终止过程 切除引物填补空缺连接切口 复制的终止阶段的工作 随从链上不连续性片段的连接 切除引物 填补空缺 连接切口 哺乳动物的细胞周期 DNA合成期 G1 G2 S M 二 真核生物的DNA生物合成 细胞能否分裂 决定于进入S期及M期这两个关键点 G1 S及G2 M的调节 与蛋白激酶活性有关 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用 真核生物每个染色体有多个起始点 是多复制子复制 复制有时序性 即复制子以分组方式激活而不是同步起动 复制的起始需要DNA pol 引物酶活性 和pol 解螺旋酶活性 参与 还需拓扑酶和复制因子 replicationfactor RF 一 真核生物复制的起始与原核基本相似 增殖细胞核抗原 proliferationcellnuclearantigen PCNA 在复制起始和延长中起关键作用 PCNA为同源三聚体 具有与E coliDNA聚合酶 的 亚基相同的功能和相似的构象 即形成闭合环形的可滑动DNA夹子 在RFC的作用下PCNA结合于引物 模板链 并且PCNA使pol 获得持续合成能力 PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标 细胞能否分裂 决定于进入S期及M期这两个关键点 G1 S及G2 M的调节 与蛋白激酶活性有关 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用 相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白 cyclin 和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶 cyclindependentkinase CDK 哺乳类动物的周期蛋白和CDK 哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质 例如锚蛋白 ankynin 是CDK4的特异性抑制物 P21蛋白能抑制多种CDK 锚蛋白和P21蛋白的抑制 活化可使细胞周期开放 关闭 因此被形容为细胞周期的检查点 checkpoint 蛋白 DNA pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性 在复制叉及引物生成后 DNA pol 通过PCNA的协同作用 逐步取代pol 在RNA引物的3 OH基础上连续合成领头链 随从链引物也由pol 催化合成 然后由PCNA协同 pol 置换pol 继续合成DNA子链 二 真核生物复制的延长发生DNA聚合酶 转换 3 5 5 3 领头链 3 5 3 5 亲代DNA 随从链 引物 核小体 真核生物复制叉的延长 染色体DNA呈线状 复制在末端停止 复制中岡崎片段的连接 复制子之间的连接 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物 去除后留下空隙 三 端粒酶参与解决染色体末端复制问题 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 3 3 5 5 切除引物的两种机制 端粒 telomere 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 通常膨大成粒状 端粒的结构特点 由末端单链DNA序列和蛋白质构成 末端DNA序列是多次重复的富含G T碱基的短序列 Pr 线性DNA复制的末端 端粒酶 telomerase 端粒酶RNA humantelomeraseRNA hTR 端粒酶协同蛋白 humantelomeraseassociatedprotein1 hTP1 端粒酶逆转录酶 humantelomerasereversetranscriptase hTRT 组成 端粒酶的催化延长作用 爬行模型 端粒酶的爬行模型 动画演示 DNA聚合酶复制子链 进一步加工 逆转录和其他复制方式ReverseTranscription OtherDNAReplicationWays 第四节 双链DNA是大多数生物的遗传物质 某些病毒的遗传物质是RNA 少数低等生物如M13噬菌体 它的感染型只含单链DNA 噬菌体的环状DNA 真核生物的线粒体DNA 采用特殊的方式进行复制 逆转录酶 reversetranscriptase 逆转录 reversetranscription 逆转录酶 一 逆转录病毒的基因组是RNA 其复制方式是逆转录 RNA DNA 逆转录病毒细胞内的逆转录现象 RNA病毒在细胞内分裂成含双链DNA的前病毒 provirus 前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息 前病毒可在细胞内独立繁殖 并可通过基因重组 recombination 参加到细胞基因组内 并随宿主基因一起复制和表达 分子生物学研究 以此作为获取基因工程目的基因的重要方法之一 称为cDNA法 以mRNA为模板 经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补DNA cDNA 试管内逆转录合成cDNA cDNA complementaryDNA 二 逆转录的发现发展了中心法则 逆转录酶和逆转录现象 是分子生物学研究中的重大发现 逆转录现象说明 至少在某些生物 RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能 对逆转录病毒的研究 拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论 滚环复制 rollingcirclereplication 三 噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制 是某些低等生物的复制形式 如 X174和M13噬菌体等 滚环复制 D环复制 D loopreplication 是线粒体DNA mitochondrialDNA mtDNA 的复制形式 D 环复制时需合成引物 mtDNA为双链 第一个引物以内环为模板延伸 至第二个复制起始点时 又合成另一个反向引物 以外环为模板进行反向的延伸 最后完成两个双链环状DNA的复制 复制中呈字母D形状而得名 D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点 内 外环复制有时序差别 DNA损伤 突变 与修复DNADamage Mutation Repair 第五节 DNA突变 指个别dNMP残基以至片段DNA在构成 复制或表型功能的异常变化 也称为DNA损伤 DNAdamage 从分子水平来看 突变就是DNA分子上碱基的改变 一 突变在生物界普遍存在 一 突变是进化 分化的分子基础 从长远的生物史看 进化过程是自发突变或自然突变 spontaneousmutation 的不断发生所造成的 二 只有基因型改变的突变形成DNA的多态性 这种突变没有可察觉的表型改变 多态性 polymorphism 一词用来描述个体之间的基因型差别现象 三 致死性的突变可导致个体 细胞的死亡 四 突变是某些疾病的发病基础 二 诱发突变的因素 大量的突变属于自发突变 发生频率只不过在10 9左右 但由于生物基因组庞大 细胞繁殖速度快 因此它的作用是不可低估的 实验室用来诱发突变 也是生活环境中导致突变的因素 主要有物理和化学因素 物理因素 紫外线 ultraviolet UV 各种辐射 化学因素 三 引起突变的分子改变类型有多种 点突变 pointmutation 或错配 mismatch 缺失 deletion 插入 insertion 重排 rearrangement 点突变 DNA分子上一个碱基的变异称点突变或错配点突变发生在基因的编码区 可导致氨基酸改变 一 点突变可导致编码氨基酸的改变 基因 谷氨酸 镰形红细胞贫血病人Hb HbS 亚基 N val his leu thr pro val glu C 肽链 CAC 基因 正常成人Hb HbA 亚基 N val his leu thr pro glu glu C 肽链 CTC 基因 镰形红细胞贫血病人 图10 29膀胱癌细胞c rasH基因点突变 基因表达产物仅12号氨基酸的变异 二 缺失 插入和框移突变 缺失 一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失 插入 原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间 缺失或插入都可导致框移突变 缺失引起框移突变 框移突变 指三联体密码的阅读方式改变 造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变 三 重组或重排常可引起遗传 肿瘤等疾病 DNA分子内较大片段的交换 称为重组或重排 移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置 倒位 也可以在染色体之间发生交换重组 由基因重排引起的两种地中海贫血基因型 DNA损伤 突变 可能造成两种结果 其一是导致复制或转录障碍 如胸腺嘧啶二聚体 DNA骨架中产生切口或断裂 其二是导致复制后基因突变 如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶 使DNA序列发生永久性改变 所以 必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制 以识别和修复这些损伤 否则细胞无法维持正常代谢 四 DNA损伤的修复有多种类型 修复 repairing 是对已发生分子改变的补偿措施 使其回复为原有的天然状态 直接修复 directrepair 切除修复 excisionrepairing 重组修复 recombinationrepairing SOS修复 修复的主要类型 一 直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤 光修复酶 photolyase UV 二 核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形 这是细胞内最重要和有效的修复方式 其过程包括去除损伤的DNA 填补空隙和连接 主要由DNA pol 和连接酶完成 E coli的切除修复机制 核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤 而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶 即参与转录偶联修复 transcription coupledrepair 转录偶联修复的意义在于 将修复酶集中于正在转录的DNA 使该区域的损伤尽快得以修复 三 重组修复 四 SOS修复 当DNA损伤广泛难以继续复制时 由此而诱发出一系列复杂的反应 在E coli 各种与修复有关的基因 组成一个称为调节子 regulon 的网络式调控系统 这种修复特异性低 对碱基的识别 选择能力差 通过SOS修复 复制如能继续 细胞是可存活的 然而DNA保留的错误较多 导致较广泛 长期的突变 AGGTACTGCCACTGG TC