毕业论文《硫氰酸红霉素的制备与检测》.doc

目录摘要：Abstract:1 引言12 实验原理23 实验药品与仪器43.1 实验药品43.2 实验仪器44 实验步骤54.1 硫氰酸红霉素制备方法54.2 液相色谱分析样品组分54.2.1 样品测定54.2.2 标品液的处理54.2.3 样品测量54.2.4 计算54.3 结束操作65 结果与分析65.1 红霉素制备结果分析65.2 红霉素检测结果与分析85.2.1 红霉素检测各组分含量85.2.2 检测波长的选择95.2.3 流动相的选择106 结论10参考文献11致谢12硫氰酸红霉素制备及高效液相检测组分含量摘要：论文介绍红霉素与柠檬酸、硫氰酸钠反应制备硫氰酸红霉素及检测组分含量的方法。此方法制备的硫氰酸红霉素符合国家标准，采用反相高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合柱（日本岛津公司）为固定相，磷酸缓冲溶液（PH=8.2）：乙腈（42:58）为流动相：流速为1.0ml/min；柱温为40；检测波长215nm。硫氰酸红霉素在此条件下分离度好；分离时间短；作为抗生素含量检测，专属性强；能准确计算出各个组分的准确数值。在工业生产中就有可操作性与可靠性。符合生产对其准确性与快速性的要求。关键词：硫氰酸红霉素；制备；高效液相色谱法1引言红霉素属大环内酯类抗生素，其临床应用超过40年，是抗生素市场中重要品种， 为了继续维持和扩大它在抗感染治疗中的作用。近年来，红霉素类衍生物的开发和应用研究较为活跃 1,2。其中硫氰酸红霉素是其衍生物之一，国外6070 年代曾报道过，由于它可以改善红霉素在水中的溶解度或减少苦味，改善药物动力学性质，降低毒副作用等，同时又具有红霉素的抗菌活性，因而得到应用，特别是在饲料添加剂中更为广泛。 硫氰酸红霉素是目前所有大环内酯类原料药品的一个关键中间体，在抗生素工业中的重要性日益突出，其主组分的纯度对下一步合成的影响至关重要目前我国将该产品归类到兽用药品中，采用生物效价法对其含量进行分析测定，而生物效价法只能对药品整个抑菌能力得到一个综合分析结果，无法对其内在组成进行精确的分析本文通过对相关资料的总结建立高效液相色谱法对其主组分进行分析，为提高质量控制提供参考3。对该品的含量测定通常采用抗生素微生物检定法，但由于硫氰酸红霉素的活性部分除主组分硫氰酸红霉素A外，还存在其他次组分如硫氰酸脱甲基红霉素A、硫氰酸红霉素B、硫氰酸红霉C、硫氰酸红霉E、红霉A烯醇醚(及部分未知杂质，尽管这些组分也有生物活性，但各组分的生物活性存在较大差异，而且某些组分经口服后极易被胃酸破坏而失去活性，因此该法的最大缺陷是方法的专属性不强。对该品的质量控制，我们认为生物效价法外，还应考虑建立合适的色谱分析方法对其有效组分和杂质概况进行控制，以保证产品质量。已报道的测定该类大环内酯类药物的HPLC4-5多采用电化学检测器，虽灵敏度较高，但样品中其他物质常有严重干扰，且电化学检测器的工作电极容易受污染，清洗或钝化处理后基线需要很长时间才能稳定。USP26版起收载的红霉素、琥乙红霉素色谱分析方法采用 L21为固定相，柱温高达6570,因填料性质特异，色谱条件不易掌握，实验难度较大。中国药典 2005年版收载的和文献报道的离子对反相 HPLC分析红霉素、琥乙红霉素等大环内酯类药物的色谱方法中，由于离子对试剂的加入，改善了色谱峰形，基本可达到各组分分离的目的，但此类离子对试剂往往紫外末端吸收比较大，基线稳定同样需要很长时间。因此上述方法的应用均受到了限制。本实验采用高pH值低离子强度的反相色谱法对硫氰酸红霉素原料药进行了分离,利用最常用的可变波长紫外检测器测定其有效成分主组分红霉素A、次组分红霉素 B、C以及其他已鉴定或未鉴定杂质的含量，同时研究了固定相牌号、柱温、流动相比例、实验浓度及溶解介质等因素对其色谱行为的影响。2实验原理3C37H67NO13+3NaSCN+C6H8O73C37H67NO13HSCN+Na3C6H5O7红霉素的分子式高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9107Pa)；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测6。其特点为：(1)高压：液相色谱法以液体为流动相(称为载液)，液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150350105Pa。 (2)高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达110ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h。 (3)高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 (4)高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 (5)适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400 以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的 75%80% )原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占7080%。高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行7。 色谱条件： 固定相:十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(三乙胺调节pH8.2)-乙腈(40：60)；流速1.0ml/min;检测波长215nm。在上述条件下，红霉素A组分的保留时间为4.486min，与杂质峰的分离度均大于1.5。3 实验药品与仪器药品名称试剂级别生产厂家红霉素工业级宁夏启元药业有限公司无水柠檬酸分析纯天津市东丽区东大化工厂硫氰酸钠分析纯天津市永大化学试剂开发中心磷酸氢二钾分析纯沈阳市试剂五厂甲醇色谱纯天津市风船化学试剂科技有限公司乙腈色谱纯天津市风船化学试剂科技有限公司3.1 实验药品3.2 实验仪器仪器名称仪器规格容量瓶100ml锥形瓶250ml磁力搅拌器上海精科90-2真空泵GLD-N201布氏漏斗FF1001高效液相色谱仪日本岛津LC-10AD紫外检测器日本岛津SPD-10A电子分析天平上海方瑞FA2104烘箱远红101A型平头进样器100ul（SGE 005300）红霉素标准品上海研生生化试剂有限公司4 实验步骤4.1 硫氰酸红霉素制备方法将红霉素30.0g（0.045mol）放入反应瓶内，同时向其中加入450ml蒸馏水，启动搅拌形成悬浮液8，缓慢滴加4%柠檬酸34.2 ml( 0. 057 mol)，搅拌至红霉素悬浮液完全溶解为清亮、透明溶液，抽滤。向滤液中加入15%的NaSCN溶液30.0ml（0.031mol），在搅拌情况下调节PH为6.5（使反应进行完全），反应1.5小时，沉淀完全后，自然冷却结晶，抽滤，用少许蒸馏水洗涤35次，75烘干，即可得硫氰酸红霉素白色粉末晶体20.0g9，收率93.0%。4.2 液相色谱分析样品组分4.2.1 标品液的处理取红霉素标准品约0.1克（精确到0.0001克）加甲醇5ml溶解，用磷酸盐缓冲液（PH=7）:甲醇15：1溶液定量稀释成每1ml约含4mg的溶液做标准液，取适量标准液经0.45um针式过滤器过滤后注入高效液相检测，记录红霉素A峰面积、B峰面积、C峰面积。4.2.2样品测量取红霉素样品约0.1克（精确到0.0001克）加甲醇5ml溶解，用磷酸盐缓冲液（PH=7）：甲醇15：1溶液定量稀释成每1ml约含4mg的溶液做标准液，取适量样品溶液经0.45um针式过滤器过滤后注入高效液相检测，记录红霉素A峰面积、B峰面积、C峰面积。4.2.3计算组分A 计算: m:标品质量 m1：样品质量A：标品组分A峰面积 A1：样品组分A 峰面积q ：标品含量% q1：样品组分A含量%按无水物计算：红A组分q1（1干燥失重）组分B计算: B1：样品组分B峰面积 A1：样品组分A 峰面积q2 ：样品组分B含量% q1：样品组分A含量%组分C计算: C1：样品组分C峰面积 A1：样品组分A 峰面积q3 ：样品组分C含量% q1：样品组分A含量%4.3 结束操作检测结束后，用流动相冲柱子到基线平稳后换成甲醇：水20:80的流动相冲柱子至少30min到基线平稳后，再换成甲醇：水87：13的流动相沖柱子至少30min到基线平稳后，按关机程序关闭高效液相色谱。5. 结果与分析5.1 红霉素制备结果分析在制备红霉素过程中，柠檬酸的加量只需将红霉素完全溶为清液即可，摩尔比为1：1.2左右，但NaSCN的用量与PH值对硫氰酸红霉素的收率影响较大，故采用不同配比与PH值对收率的影响进行研究，温度对实验影响不大，一般控制于室温即可。结果见表1、2、3。表1 NaSCN用量对收率的影响Table 1 The influence of NaSCN amount to the yield序号红霉素：NaSCN/摩尔比收率，%11：1.0090.821：1.0591.231：1.1093.241：1.1594.551：1.2094.6由表1可见，4、5的收率较高，说明红霉素与NaSCN反应生成硫氰酸红霉素时，NaSCN是过量的，其摩尔比为1：1.15时比较合适，此时NaSCN的量再增加，收率也基本保持不变，即NaSCN过量对收率无影响。表2 pH值对收率的影响Table 2 pH value to the yield influence序号pH收率，%16.390.826.594.736.794.547.093.757.390.7 表3 反应时间对收率的影响Table 3 the influence of reaction time to the yield 序号反应时间/小时收率，%10.591.621.094.131.594.542.094.652.594.7由表2、3可见当pH=6.5时反应进行的彻底，收率较高；反应时间为1.5小时比较合适，继续增加反应时间，收率基本不变。5.2 红霉素检测结果与分析5.2.1 红霉素检测各组分含量名品萄样称名定分组组分组实定值A组分B组分C组分红霉素标品93.5%2.15%0.76%红霉素样品89.3%3.78%1.37% 红霉素标准品图谱Erythromycin standard product mapping 红霉素检测品图谱 Erythromycin detection product mapping5.2.2 检测波长的选择 取红霉素标准品用流动相溶解并制成每1mL中含0.5mg的溶液，在190nm-300nm的波长范围内扫描，在215nm的波长处有最大吸收，因此选择215nm为检测波长10。5.2.3 流动相的选择流动相中磷酸二氢铵溶液的盐浓度和值不同，配制的流动相拖尾因子不同，结果显示在磷酸盐：乙腈42：58是色谱图分离度好。6 结论 红霉素与柠檬酸、硫氰酸钠在室温下反应其物料比为：红霉素：柠檬酸：硫氰酸钠=1:1.30:1.25，pH值控制为6.5，反应时间为1.5小时。流动相组成为磷酸盐：乙腈=42:58时，分离效果好，且检测时间较短。符合工艺上对其准确度与时间的要求。参考文献1 陈悦. 反相HPLC 分析硫氰酸红霉素的相关物质及主组分含量J.中国药学杂志, 2007,42（23）:18221826.2 魏琦, 李欣. 反相高效液相色谱法测定硫氰酸红霉素组分, 基层医学论坛2009,13,10,920921.3 Ch1P (2005)Vol (中国药典2005年版1二部) S 12005:222231.4 王文梅. 中国医药工业杂志, 1993, 24(7) : 325328.5 陈泳洲, 汪敦佳, 王国宏. 湖北师范学院学报, 1996,16 (3) : 1517.6 陈雪梅, 廖君. 红霉素含量测定的研究.7 顾觉奋, 刘昂, 吴梧桐. 大环内酯类抗生素的基因工程研究J药物生物技术 2002,9（4）: 246250.8 齐霞昌, 陈昌发, 钱江潮, 储炬, 庄英萍, 张嗣良. 采用高效液相色谱测定红霉素发酵液组分J. 食品与发酵工业, 2009, 35(15):1511549 杨锦昌, 刘桂生, 蒋佩蓉. 复方硫氰酸红霉素中硫氰酸红霉素效价测定的探讨J. 中国兽药杂, 1998,32(4) :222510 吴一骊. 薄层层析法测定红霉素A含量J, 上海医药 1998