总双乙酰-分光光度法.doc

批准： 杨永霖质量Pillar审核：沈洪武 康黎东 吴德新 编写：林琴 编号:Q/SBJ4(品)2.07-2010版本：第5页共4页名称TVDK分光光度法 保 密日期：2010年6月12日总双乙酰分光光度法1. 目的1.1采用紫外分光光度法测定啤酒中的联二酮和他们的前驱物。2. 范围2.1本方法可用于过滤后的啤酒和未成熟啤酒 ，未成熟啤酒在分析前须经过滤或离心处理。3. 原理3.1联二酮的前驱物在60下转换成VDK，然后VDK从啤酒中被蒸馏出来，蒸馏物和邻苯二胺反应生成2，3-二甲基喹喔啉的衍生物。经过酸化之后，反应物的含量通过分光光度计可测量，VDK含量通过标准系数换算。4. 安全预防4.1 遵守实验室常规安全规定。4.2 邻苯二胺为有毒品并可能引起过敏性反应，使用时小心，要戴橡胶手套。4.3 整个蒸馏过程中，温度都较高，要戴隔热手套，防止烫伤。5. 试剂5.1 盐酸溶液：4mol/l，按GB/T601配制；5.2 邻苯二胺：10g/l，称取邻苯二胺0.1g，溶于4mol/l盐酸溶液中，并定容到10ml，摇匀，放于暗处。此溶液须当天配制和使用；若配制出来的溶液呈红色，应重新更换新的。5.3 双乙酰贮备液，5g/L，水溶液。溶液应贮存在棕色瓶中冷藏，有效期：6个月。5.4 双乙酰标准溶液，250 mg/l。移取5 ml双乙酰贮备液用蒸馏水定容到100 ml，有效期6个月。6. 设备和仪器6.1 蒸馏装置：带有加热套管的双乙酰蒸馏器，适用于蒸馏100ml样品；6.2 蒸汽发生器：2000ml（或3000ml）锥形瓶或平底蒸馏烧瓶；6.3 紫外分光光度计：岛津UV-2450 ，备有10mm石英比色皿； 6.4 容量瓶：25ml6.5 量筒：100ml6.6 具塞玻璃比色管：25ml6.7 夹锁瓶：500ml7. 样本准备7.1 取样：取样时废液要排半桶以上才使样品具有代表性，取完样品应尽快放到冰箱里冷藏。 7.2 样品前处理： 过滤后啤酒：把经中速滤纸过滤后的啤酒装入夹锁瓶中，盖紧后，在60水浴中放置90分钟。 发酵液：含有酵母的样本须经离心澄清（3000转，10min） 或过滤，在过滤纸上加入20.5克硅藻土，过滤以清除酵母和二氧化碳。把过滤后的发酵液装入夹锁瓶盖紧后，在60的水浴中放置90分钟。7.3 蒸馏前期工作：蒸馏前应确认冷凝水有开，蒸馏瓶中的水不能超过2/3容量，而且应加入沸石或玻璃球以免暴沸伤人。8. 规程8.1 样品检验： 用量筒量取100 ml冷却至室温左右的样品加入到蒸馏瓶中，蒸馏样品并用量筒收集最初的馏出液25 ml,确保加热蒸馏时间至少6分钟。 确保蒸馏时间在8至10分钟，蒸馏后混匀溜出液。 吸取10 ml馏出液到一干燥试管中，加入0.5ml邻苯二胺到试管中，摇匀，将混合物在暗处放置20 到 30 min。加入2 ml盐酸溶液(4mol/L)到反应混合液中并摇匀，以超纯水作空白在335 nm下测吸光度A335。8.2 空白检验： 在检验测定的同时平行做空白试验,用10 ml蒸馏水代替馏出液。吸取10 ml蒸馏水到一干燥试管中，加入0.5ml邻苯二胺到试管中，摇匀，将混合物在暗处放置20 到 30 min。加入2 ml盐酸溶液(4mol/L)到反应混合液中并摇匀，以超纯水作空白在335 nm下测吸光度Abl。8.3 校准：移液管吸取9.90 ml水到一干燥试管中，加0.10 ml双乙酰标准溶液混匀。加入0.5ml邻苯二胺到试管中，摇匀，将混合物在暗处放置20 到 30 min。加入2 ml盐酸溶液(4mol/L)到反应混合液中并摇匀，以超纯水作空白在335 nm下测吸光度Ast。9. 结果和方法可靠性的表述9.1 1. 总联二酮含量(mg/L)计算公式： TVDK = A 335 - Abl x 0.625 x1000 (g/l) Ast - Abl （C1）式中：TVDK试样的总双乙酰含量，单位为微克每升（g/l）；A335试样在波长335nm下，用10mm石英比色皿测得的样品检验的吸光度 ；Abl蒸馏水在波长335nm下，用10mm石英比色皿测得的空白检验的吸光度；Ast标准溶液在波长335nm下，用10mm石英比色皿测得的校准的吸光度。所得结果应表示至整数。2. 精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%3. 重要说明: 如果分母(Ast - Abl)偏离0.2300.030,则通过重新制备新的双乙酰蒸馏液来调查原因.10. 附注10.1 注意事项：易挥发/变质的试剂如邻苯二胺应现配现用；注意蒸馏的时间应在到min之内，蒸馏到样品快接近刻度时要马上停止，马上盖上盖子。暗室反应的时间应严格控制在预定的时间之内，且测量要尽快完成，否则时间延长会导致测量结果偏高。岗位所使用的玻璃用具要清洗干净，测定用石英比色皿要保持干净透亮。 10.2 分光光度法检测的联二酮含量并不直接与气相色谱法测定的总双乙酰和总2.3-戊二酮相较,因为如下原因：戊二酮以双乙酰计算(其分子量分别100和86)，约5%-10%的戊二酮没有被蒸馏出来。考虑这二个因素，EBC分析协会规定了下面的计算公式：总联二酮(spectro)=总双乙酰（GC）+0.8*总戊二酮(GC)文件历史记录版本作者日期版本说明自前一版本以来的