（一）淀粉酶的离子交换层析.doc

生化实验报告之六： 综合实验报告人：蔡泽恩学 号:080700401组 别：15同组人：周智敏 指导教师：张雯实验日期：2009-5-1至2009-5-27缴交报告日期：2009-6-15 （一）淀粉酶的离子交换层析一实验目的： 采用离子交换树脂分离蛋白。掌握离子交换层析的基本的操作技术。二实验原理： 各种蛋白质分子在同一ph值时带电量不同，与离子交换树脂的亲和力有差异。因此可以根据亲和力由大到小的顺序被洗脱峰洗脱下来，达到分离的效果。三实验试剂与器材：(1)试剂与材料 淀粉酶溶液（大约10mg/ml）、离子交换树脂（DEAE-纤维素）、平衡缓冲液（pH8.0,0.02MTris-HCl缓冲液）、 NaCl固体(2)器材 20cm*1cm层析管、试管（10ml*/120）、试管架、梯度混匀器、蠕动泵、 部分收集器、分光光度计、分析天平四实验步骤 ：（1） 装柱：取直径1cm，长度为1012cm的层析柱。将柱垂直于铁架上。关闭层析管出口，自顶部注入经处理（膨胀、预先用pH8.0,0.02MTris-HCl缓冲液平衡）的树脂悬浮液，待树脂沉降后，放出过量溶液，再加入一些树脂，至树脂沉降至层析柱的3/4处即可。（2） 平衡：用平衡缓冲液把层析柱加满，与层析柱入口相连的管经排气后，与入口相连。用平衡缓冲液以2.0ml/min的流速平衡树脂。（3） 上样：打开出口，让柱内缓冲液液面与树脂面相切，关闭出口；由柱上端仔细加入0.5ml的蛋白样品，打开出口，让样品进入树脂，同时开始收集流出液，当柱内液面与树脂面相切时再关闭出口；加入平衡缓冲液冲洗加样品处，带缓冲液面与树脂液面相切时，再加入缓冲液，重复此步骤。（4） 洗脱：将0.3mol（0.877g）NaCl与平衡缓冲液50ml混合做为洗脱缓冲液1，将0.5mol(1.462g)NaCl与平衡缓冲液50ml混合做为洗脱缓冲液2。分别用洗脱缓冲液1、2以2ml/min的速度洗脱；每3min收集一管，共收集2025管，测定各管A280nm.（5） 绘制洗脱曲线收集吸收峰的试管，倒入5ml离心管，写上学号，置于冷藏备用。（共有三个吸收峰）五注意事项1.实验过程应控制好层析柱的液面，以免树脂干掉；2.平衡树脂时，应先用缓冲液将层析管液封，赶出空气；与层析柱相连的入口管也应事先排气，以免气体进入层析柱，导致液面不稳。六实验数据：管数123456789A2800.1720.0720.0570.0790.0620.0460.0520.0330.033管数101112131415161718A2800.0330.0430.0390.0340.0330.0330.0210.0830.08管数192021222324252627A2800.0620.1160.2090.2440.2550.2340.2220.2090.203管数282930313233343536A2800.1970.2340.2100.2670.2440.2410.2420.2470.233洗脱曲线：思考题： 离子交换分离蛋白的原理是什么？ 答：各种蛋白分子在同一PH值时带电量不同，与离子交换树脂的亲和力不同。 （二）淀粉酶的活力测定一实验目的：经过本次试验，掌握酶活力测定的一般流程，还原糖的测定方法。二实验原理： 淀粉是葡萄糖以a-1,4糖苷键及a1-6糖苷键连接的高分子多糖，是植物植物最主要的储藏多糖，也是人和植物的重要食物和发酵工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉酶的总称。淀粉酶作用淀粉后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括a-淀粉酶和淀粉酶两种。a淀粉酶可以随机的作用于淀粉中的a-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的黏度降低，因此又称液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又称为“糖化酶”本实验内容为测定实验（一）中收集的洗脱峰原淀粉酶中的a-淀粉酶的活力。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3，5，-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3氨基5-硝基水杨酸，淀粉酶的活力大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的葡萄糖溶液这座标注曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶的活力。三实验器材和原料1、实验材料 淀粉酶原液和洗脱峰2、仪器： 恒温水浴（40、100）、 试管：21*2100型试管20支 试管架（带编号）、 刻度吸管：2ml*1，1ml*4，10ml*1 烧杯（50ml*1）、分光光度计3、试剂（均为分析纯）（1） 标准葡萄糖溶液（1mg/mL）；精确称取100 mg葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100 mL。（2）3，5二硝基水杨酸试剂：精确称取3，5二硝基水杨酸1g，溶于20 mL2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL。盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。若溶液混浊可过滤后使用。（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：（0.1mol/L柠檬酸）：称取C6H8O7H2O 21.01 g，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O72H2O 29.41 g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55 mL 与B液145 mL混匀，既为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液。（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100 mL0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液中。（本次实验四种溶液已经配好）四实验步骤1、葡萄糖标准曲线的制作表1 葡萄糖标准曲线制作试管号试剂1234567葡萄糖标准液ml0.00.10.30.50.70.91.0蒸馏水ml1.00.90.70.50.30.10.03，5二硝基水杨酸ml1.01.01.01.01.01.01.01.取14支干净的试管，编号，按表1加入试剂，做两份平行 2.摇匀、置沸水浴煮沸5min3.取出后冷却接近室温，加蒸馏水8ml，即总体积为10ml4.以1号管为空白调零，在540nm波长下比色测定光密度，个浓度均取平均值以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制曲线。1、 酶活力的测定（以淀粉酶原液为例，其他各组洗脱峰处理方法类似）表2 酶活力测定取样表操作项目淀粉酶活力测定I-1I-2I-3添加2%淀粉溶液ml0.50.50.5预保温将酶液和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min3，5二硝基水杨酸ml1.0 00淀粉酶液ml 0.5 0.50.5保温立即放入100沸水浴5min在40度恒温水浴中准确保温10min3，5二硝基水杨酸0.01.01.0沸水浴5min定容加入8ml蒸馏水 取3支干净的试管，编号，按表2进行操作。将各试管摇匀，显色后进行540nm比色测定光密度，记录测定结果。【实验结果】表3：葡萄糖标准曲线光密度 管号组别 1234567A5400.0000.0150.0270.2630.3900.5170.577A540平均0.0000.0150.0270.2630.3900.5170.577标准曲线的绘制：以葡萄糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。曲线如下：表4洗脱峰与酶原液活性测定数据记录表编号样品I1I2I3I-2与I-3的平均值酶原液0.0000.0840.0850.085洗脱峰10.0000.0200.0180.019洗脱峰20.0000.0530.0560.055洗脱峰30.0000.0380.0350.037由于洗脱峰1测出的光密度是负值，故舍去该组数据。酶活力单位的定义：此反应条件下，温度40，PH=5.6,以2%淀粉为底物，反应1min转化1mol还原糖为1U。酶原液的光密度为=0.085酶原液所还原的葡萄糖含量=0.0850.0005=170ug淀粉酶活力的测定=170/180/0.5/10=0.18则1mL唾液淀粉酶的酶活力=10*0.018=1.8洗脱峰1的光密度为=0.019洗脱峰1所还原的葡萄糖含量=0.0190.0005=38洗脱峰1活力的测定=38/180/0.5/10=0.04则1mL洗脱峰1的淀粉酶活力=10*0.04=0.4洗脱峰3的光密度为=0.037洗脱峰3所还原的葡萄糖含量=0.0370.0005=74洗脱峰3活力的测定=74/180/0.5/10=0.082则1mL洗脱峰3的淀粉酶活力=10*0.082=0.82洗脱峰2的光密度为=0.055洗脱峰2所还原的葡萄糖含量=0.0550.0005=110洗脱峰2活力的测定=110/180/0.5/10=0.12则1mL洗脱峰2的淀粉酶活力=10*0.124=1.2 思考题：（1）唾液和淀粉溶液为什么用100ml0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液稀释？答：淀粉酶的最适pH是4.75.4，把唾液用100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液稀释，可以使它达到最适pH，使其表现出最大活性，以加快反应速度。（2）为什么要将各试管中的淀粉酶液和1%淀粉溶液分别置于40 水浴中预保温？答：预保温是为了消除起始温度不同而引起的误差，同时也使酶处于最适温度加快反应进行。（3）淀粉酶和淀粉溶液混合后再40水浴中保温是为什么？答：使淀粉酶酶处于它的最适温度，表现出最大活性，加快反应速度。（4）I-1试管为什么先加入3，5二硝基水杨酸？答：使I-1试管中的酶失活，作为I-2试管和I-3试管的对照。（5）100沸水浴的目的是什么？答：使还原糖和3,5-二硝基水杨酸的反应能充分快速进行，在淀粉酶活性测定中还可使淀粉酶完全失活。（三）Folin-酚法测定蛋白质含量一实验目的： 测定实验中原液和洗脱峰中蛋白的含量。掌握folin-酚法测定蛋白含量的原理和方法，熟悉分光计的操作。二实验原理：folin-酚法包括两个步：第一个步骤是在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步骤是此络合物磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色的磷钼酸-磷钨蓝混合物，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。三实验材料、主要仪器和试剂1、实验材料 洗脱峰液体、原液2、仪器 移液管（0.5ml、1ml、 5ml ）、量筒、分光光度计3、试剂 0.5mol/lNaOH、试剂甲、试剂乙、标准牛血清白蛋白实验时这四种试剂已配好四操作步骤1、标准曲线的制作表1 牛血清白蛋白标准曲线制作试剂管号123456牛血清白蛋白（ml）0.00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20.0取12支普通试管，按表1加入标准浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水 加入试剂甲5ml，放置10Min,再加入试剂乙0.5ml，立即混合均匀 30min后，以一号试管为对照，用分光光度计于560nm下测光密度 以牛血清白蛋白含量（ug）为横坐标，以光密度为纵坐标2、样品制备及测定（包括两个洗脱峰和酶原液）从洗脱峰中各取1ml溶液，分别加入5ml甲，混合放置10min 再加入试剂乙0.5ml,迅速混合均匀，放置30Min 于650nm波长下测定光密度 五实验结果1、牛血清白蛋白溶液标准曲线数据表管号123456A6500.000.0630.1070.1670.2210.272牛血清白蛋白溶液标准曲线制作如下2、 样品的测定数据表 样品洗脱峰1洗脱峰2洗脱峰3酶原液A6500.0690.0860.0830.009由于上次试验各洗脱峰的含量剩余不多，所以此次只做了一组，没有对照组。4、样品及原液的测定计算出两重复样品光密度的平均值，从标准曲线中查出相对应的蛋白质含量X（ug），再按下列公式计算样品中蛋白质的百分含量。计算式蛋白质含量（%）=X（ug）/体积ml106100酶原液蛋白质含量=8.18（1106）100=0.0008洗脱峰1蛋白含量=62.7（1106）100=0.0062洗脱峰2蛋白质含量=78.1（1106）100=0.0078洗脱峰3蛋白质含量=75.4（1106）100=0.0075六回答课后思考题查阅课本、参考书，试述有几种方法测定蛋白质含量的方法，极其简要原理和优、缺点测定方法简要原理耗时干扰物优点缺点凯氏定氮法（Kjedahl法）将样品蛋白质的氮经消化，经转化成无机氮（氨）用酸吸收滴定。根据蛋白质中氮的含量为16即可求出蛋白质含量。810小时非蛋白质氮（可先用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）等样品不需要可溶，对所有蛋白质的测量都一致，干扰少，用于准确测定；适用于0.22mg氮。耗时长，操作繁琐，装置须要大量样品；检测氮时缺乏专一性。 双缩脲法（Biuret法）具有两个及两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，蛋白质亦可以发生此反应。多肽键碱性Cu2 紫红色络合物；颜色深浅与其浓度成正比2030min硫酸铵Tris缓冲液某些氨基酸等简便快速，不受蛋白质特异性影响，不同蛋白质显色相似。灵敏度低所需样品量在（0.21.7）mg/ml紫外吸收法蛋白质分子中Lys和Try在280nm处有最大吸收峰，且在各蛋白质中的含量相近。得蛋白质在280nm处得吸光度与浓度成正比510min各种嘌呤、嘧啶，各种核苷酸等（可以校正换算回来）方法简便、测定迅速，样品可回收，低浓度盐无干扰，可适用与层析柱流出液得检测不同蛋白质中Lys、Try含量不同而使测量结果产生误差，其他具有紫外吸收的物质有干扰。Folin酚法（Lowry-法） 双缩脲反应磷钼酸、磷钨酸试剂被Try、Phe残基所还原，蓝色与蛋白浓度成正比4060min硫酸铵Tris缓冲液甘氨酸各种硫醇等灵敏度高可检测到最低蛋白质含量可达到5g，可测定范围是20250g各种蛋白质含有不同量的Lys、Phe，显色的深浅随不同的蛋白质而变化。通常只适用于测定蛋白质的相对浓度考马斯亮蓝G250法(Bradford法)考马斯亮蓝G250染料在酸性溶液中与蛋白由范德华力结合，溶液由棕黑变为蓝色lmax由465nm变为595nm5-15min强碱性缓冲液等灵敏度高：可检测到1g；测定快速简便；干扰物少；颜色稳定性好。由于Arg、和芳香氨基酸含量不同造成不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差七结果分析： 本次实验较为成功，在熟练掌握分光分度计及实验步骤的基础上，实验做的比较得心应手。八结论：在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物，此络合物将Folin试还原，产生深蓝色，颜色深浅与蛋白质含量成正比。通过测定A650nm吸光值制定牛血清白蛋白溶液中蛋白质含量的标准曲线，最后计算得出：酶原液蛋白质含量为0.0008洗脱峰1蛋白含量为0.0062洗脱峰2蛋白质含量为0.0078洗脱峰3蛋白质含量=为0.0075（四）SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度一实验目的利用SDSPAGE电泳的方法鉴定蛋白质纯度的方法和操作都较为简单，通过实验最终得到电泳图。通过电泳图可以判断不同种类的蛋白质。通过实验要掌握电泳技术的原理方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，并对蛋白质分离纯化有初步认识。二实验原理及背景在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中加入SDS，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与它所带的电荷及分子形状无关。在一定条件下，蛋白质相对分子质量与迁移率存在下列关系：即 式中，相对分子质量Mr的对数与相对迁移率m呈线性关系，k及k1均为常数，b为斜率，相对迁移率为m，即M=在实际测定中，常常用几种已知相对分子质子量的单体蛋白质作为标准，根据相对分子质量和实际迁移率作图，然后由样品的迁移率即可从图上求得其相对分子质量。三，实验装置及材料1.试剂：本实验采用不连续电泳，12.5的分离胶分离酪蛋白。需要试剂可参见表1-4。表1 SDS-PAGE电泳液的配制名称调制法保存不连续电泳胶制备A液（30%胶液）丙稀酰胺29.2gN，N-甲叉双丙烯酰胺0.8g石英水定容至100ml4B液（分离胶缓冲液）1.5M TRIS-HCl缓冲溶液（pH8.8）TRIS 18.2gSDS 0.4g盐酸 2ml石英水定容至100ml4C液（浓缩胶缓冲液）0.5M TRIS-HCl缓冲液（pH8.8）TRIS 6.1gSDS 0.4g盐酸 4.2ml石英水定容至100ml4聚合起始剂过硫酸胺 0.2g石英水1ml溶解室温，现用现配聚合促进剂TEMED4电极用缓冲液25mM TRIS，0.01M GLY，0.1SDS TRIS 3g GLY 14.4g SDS 1g 石英水定容至1000ml 4考马氏染色法固定液 乙醇 500ml 冰醋酸 100ml水 400ml室温染色液 考马斯亮蓝R-250 0.29g 褪色液 250ml室温褪色液95乙醇 250ml冰醋酸 80ml用水定容至1000ml室温表2分离胶的配制5%7.5%10%12.5%15%20%A液（ml）34.567.5912B液（ml）4.54.54.54.54.54.5纯水（ml）10.597.564.51.5过硫酸胺（l）404040404040TEMED（l）101010101010分子量范围78，000400，000-38，000200，000-25，000100，000-14，00080，000-10，00010，000表3 浓缩胶的配制A液0.8mlC液1.5ml纯水3.7ml过硫酸胺30lTEMED6l合计6ml表4样品处理实验液配方 非还原还原SDS（十二烷基硫酸钠）（g）0.80.8C液（见表1）（ml）55甘油（ml）88纯水（ml）4040二-巯基乙醇（ml）4溴酚蓝（mg）30302.样品牛奶、粗制酪蛋白、酪蛋白标准品100mg/mL溶液，低分子量蛋白标准品。四实验步骤：1. 电泳前的样品处理 用移液枪移取样品澄清液100l于0.5毫升离心管，然后加入50l还原处理液（见表4），将离心管于沸水浴中加热5分钟。2. 制备凝胶过程（1）固定好玻璃板，保持良好的密封性，可用石英水检测有无泄露；（2）配好所需浓度的分离胶溶液（本实验采用12.5的分离胶），将容易注入两玻璃板之间至距板顶1厘米多处停止灌胶，然后滴入适量无水乙醇，使其界面平齐，至凝胶凝固。倒出酒精，注入石英水清洗数遍后，用滤纸吸干，注入浓缩胶至顶部，小心插入开有开有小槽的塑料片（称为梳子），注意尽量不产生气泡。待胶凝固。（3）将电解液注入电泳槽中，将电泳板斜放入，注意底部不要留有气泡，将电泳板固定后再将电解液注满电泳上槽，小心取出梳子，保证样品槽平整。3.上样、电泳（1）用微量注射器向样品槽中注入5l样品，注样速度应适中，太快会使样品在压力作用下而扩散。加样完毕后打开直流稳压电源，保持电压或电流强度不变进行电泳。通常采用恒压120V或恒流25-30mA进行电泳。（2）待指示剂前沿走到电泳板底部时，关掉电源取出电泳板。4.染色（考染）轻轻取下凝胶置于染色液中。先用固定液固定30分钟，于60下染色（考染法染色）10分钟左右，放入褪色液中褪色。将褪色完的凝胶干燥，量出电泳带的距离，做标准曲线，确定蛋白质的分子量。五实验结果实验得到的电泳图如下所示：（13.15）六讨论1.此次得到的实验结果是失败的，各蛋白质之间没有出现分离，得到的电泳图如上图所示。2.实验过程中的一些实验试剂是几个组临时配制并共享使用的，