xhaled_nitr_= ic oxide in--哮喘和FENO_1996(前)(max completed).doc

哮喘患者呼出一氧化氮的增加主要来自下呼吸道SERGEI A. KHARITONOV, K. FAN CHUNG, DAVID EVANS, BRIAN J. OCONNOR, and PETER J. BARNESDepartment of Thoracic Medicine, National Heart and Lung Institute, London, United Kingdom一氧化氮（NO）是人体呼出空气中的可检出气体，哮喘患者的呼出气体中，一氧化氮浓度会增加。我们利用不同的呼气方式和直接对上，下呼吸道进行采样调查，研究了哮喘患者呼出气体中所增加NO的来源。呼出的NO通过化学发光分析仪测量。 正常人组在受阻呼吸，呼出流量为1 L / min时，NO的浓度为783 ppb（n = 46） ，哮喘患者则有显著升高（30126 ppb，N = 30 ，P 0.001）。呼出NO值在以5 L / min通畅呼吸时，从侧臂采样的测量值降低到（71 ppb），哮喘患者同样高出正常组（466 ppb，P 0.001） 。屏气20秒后，开始呼吸时呼出的NO值最高，呼气接近完成时，数据与通畅呼吸时接近。鼻腔中的NO浓度高于呼出气体中（99639 ppb）的浓度，哮喘患者比正常人更高（139071 ppb，P 0.002）。通过纤维支气管镜对气管和右肺中叶支气管进行直接取样，取得5名正常人和15名哮喘患者在通畅呼气时的值，呼出空气和直接采样之间有良好的相关性（气管R = 0.91 ，右肺中叶R = 0.87，P 3mm），至少有两种常见的吸入性过敏反应（花粉，屋尘螨，猫毛，Aspergitlus fumigatusi）,呼吸道反应上升，确定方式是：小于8mg/ml的高浓度乙酰甲胆碱可使FEV I (PC 20 )下降20%。 所有的患者均接受所需的吸入式2受体激动剂治疗，且在之前3个月内未使用吸入糖皮质激素或口服类固醇。研究开始前至少4周内，无上呼吸道感染史。无当前吸烟者。其中虽有两人之前吸烟，但都在早于5年以前停止吸烟。表一正常及哮喘个体的特征年龄性别AtopyFEVlFVCPC20+(yr)(M/F)(+/-)(% pred)(% pred) (mg/ml)正常人 n = 4632 4 40 M6+95 5964 16哮喘患者n = 3028 524 M30+91 493 5 3.3简语定义：: FEV1 = 每秒用力呼出量； FVC = 用力呼出肺活量； PC20 =可使FEV1 下降 20% 的高浓度的乙酰甲胆碱* 平均 SEM 值.t 几何平均值研究设计对所有控制个体和哮喘患者进行四种独立的呼出NO测量： （1）以全部肺活量（TLC）对分析仪进行的受阻呼出（受阻呼出NO）; （2）以全部肺活量（TLC）和最小阻力，缓慢无障碍地对分析仪呼吸，并从侧臂对NO进行取样（终期呼出NO ，顺畅呼吸）; （3）屏息20秒后，以全部肺活量（TLC）和最小阻力，缓慢无障碍地对分析仪呼吸（最终呼出NO ，屏息）; （4）屏气期间抽样（鼻腔NO）。此外，对10名男性哮喘患者和五名正常人（四男）志愿者，进行了下呼吸道纤维支气管镜NO测定。所有的测量都在上午进行。 该程序由 Royal Brompton Hospital Medical Ethics Committee 批准，所有被研究者均书面同意参加。 一氧化氮测定呼出NO的测定采用化学发光分析仪（Model LR2000; Logan Research, Rochester, UK），NO灵敏度为1到5000单位（ppb，体积比），识别率为0.3ppb，以用于在线记录呼出的NO浓度。此功能省却了利用收集器对气体进行收集的需要，也消除了因此造成的NO损失，提高了灵敏度（响应时间0.5秒）和重复使用的便利。除了一氧化氮，分析仪还可对CO2（精确度为0.1%CO2，响应时间200毫秒）、样本压力和容量进行实时测量。分析仪已配备反馈控制单元，可保持压力（3 0.4 mm Hg）和流量（顺畅呼吸时5 L / min，受阻呼吸时1 L/min）在一定范围内，消除对NO记录的影响。因此在吹嘴，以及随后在反应室中产生的压力，其变化可忽略不计( 0.1 ppb)，不会影响NO读数。该电子分析仪在所有测试中的采样速率是250 ml/min。每天采用检测过的氮气与NO混合物（90 ppb 和 500 ppb）和5% CO2（BOC Special Gases, Surrey Research Park, Guildford, UK）对分析仪进行校准。环境空气中的NO，在每个个体测定前后均被记录。受阻NO呼出量是在45秒内，以最大肺活量，经分析仪的广口Teflon管道向分析仪呼气，流速约为1L/min，因此，为呼出提供阻力（受阻呼出NO值）。在受阻呼吸时，对峰值呼出NO值进行了测定。在这种测量中，浓度曲线下的区域与峰值NO值密切关联（r =0.98）；因此，在所有的计算中，均采用峰值。被测者接着以类似方式，在30秒内，以最大肺活量和5L/min的流速，不经过分析仪，以最小阻力呼气。从侧臂对NO进行取样（终期呼出NO ，顺畅呼吸）。通畅呼气时的终期呼出NO浓度，与终期呼出CO2读数（5 CO2）平滑部分对应的值，被作为肺泡样品的代表值。这种使用自由呼吸气流的测量方法，在屏息20秒后，被重复测定（终期呼出的NO-屏息）。在所有测试中，被测者均佩戴有鼻夹。借助分析仪中压力和容量传感器的可视化流速显示，使呼吸过程中的压力，在测试期间保持恒定（3 0.4 mm Hg）。鼻腔NO的测量需要在被测者屏息，无主动呼出时，将Teflon管插入一个鼻孔。这有助于分析鼻腔内，在自由流动的环境空气（250 ml/min）中，从一个鼻孔进入另一个鼻孔，然后直接进入分析仪时的NO浓度。每次安静休息至少15分钟后，测试取得本轮测试的基线值。下呼吸道NO测定，采用细孔Teflon管，由纤维支气管镜的钳子通道（Olympus, KeyMed Ltd., Southend, UK）置入。被测试者术前在30秒内进行2毫克咪达唑仑静脉注射，2分钟后，如果镇静作用不充分，可随后增加0.5-1.0毫克。局部麻醉采用4的盐酸利多卡因。测量时要求被测者屏息15至20秒（即，该测试不需要呼气），同时通过支气管镜，在气管的下端和右中叶口，对气管和支气管的NO值进行测定。套管在直视下置入，测得NO的峰值。由于这种测定方法的实际问题，我们无法测量呼气时的NO值。至于受阻呼吸时的NO测量，曲线下的区域与峰值NO值密切关联，因此，验证了使用NO峰值的合理性。不同呼吸方式时，样本中的二氧化碳含量也被记录。分析的结果以曲线图表的方式展现，包含不同时间的NO浓度、二氧化碳浓度、压力和流量的曲线。肺功能及支气管动力试验FEV1和用力呼吸的肺活量（FVC），利用干肺量计（Vitalograph, Buckingham, UK）进行测定。三种呼吸中的最佳数值，被以预测值的某个百分比来表示。哮喘患者呼吸道反应性的测定，通过乙酰甲胆碱在支气管诱发的反应来实现。该溶液利用输出量为100 ul的手持式雾化器（Dosimeter MB3; MEFAR, Bovezzo, Italy）进行雾化。 PC20根据通过插值对数的剂量 - 反应曲线计算。统计分析正常和哮喘患者的NO值，经过Students t test 方式进行比对。经方差分析（ANOVA）进行组间比较。所有的结果记作 SEM平均值。A p 值 0.05 可视化显著差异。表二正常及哮喘患者的受阻呼吸峰值、顺畅呼吸末期值和鼻腔NO值呼出NO浓度值（ppb）不屏息受阻呼出峰值顺畅呼吸末期值峰值呼出末期呼出鼻腔NO (ppb)正常人 n = 4678 37113 171996 39哮喘患者n = 30301 26t46 6t172 29t54 7t1,390 71+* 数据为平均 SEM .t p 0.001 (ANOVA), 与对照组有明显不同:I: p 0.002 (ANOVA), 与对照组有明显不同图 1。呼出一氧化氮 (NO) 在受阻呼吸中被测定 (峰值受阻呼出). (A) 正常个体的跟踪曲线；NO (ppb), 肺泡CO2 (%) (B) 哮喘患者对应的跟踪值。 (C) 来自46 个正常个体(开放符号) 和 30 个哮喘患者的数值(封闭符号)。平均值由水平线标志。图 2. 呼出 NO 值，在最小阻力情形下，从侧臂（顺畅呼吸，末期值）取样测试 (A) 正常个体的跟踪曲线；NO (ppb), CO2 (%)，流速和压力被同步测定。 (B) 哮喘患者对应的跟踪值。(C) 来自46 个正常个体(开放符号) 和 30 个哮喘患者的数值(封闭符号)。平均值由水平线标志。图 3. 呼出 NO 值，屏息20秒后，在慢速，最小阻力情形下，从侧臂（顺畅呼吸，末期值）取样测试 (A) 正常个体的跟踪曲线；NO (ppb), CO2 (%)，流速和压力被同步测定。 (B) 哮喘患者对应的跟踪值。(C) 来自46 个正常个体(开放符号) 和 30 个哮喘患者的峰值和持续NO数值(封闭符号)。平均值由水平线标志。图 4. 呼出 NO 值，屏息时由鼻腔测定。 (A) 正常个体的跟踪曲线；NO (ppb), CO2 ，CO2无法检出，意味着没有来自下呼吸道的空气污染。 (B) 哮喘患者对应的跟踪值。(C) 来自46 个正常个体(开放符号) 和 30 个哮喘患者的数值(封闭符号)。平均值由水平线标志。图 5. 顺畅呼吸时，呼出 的NO 值，以及通过纤维支气管镜，直接对气管和右肺中叶(RML)进行测定的值。正常个体(n = 5, 开放符号) 和哮喘病人(n = 15, 封闭符号)的检出值。平均值由水平线标志。结果呼出一氧化氮浓度不同方法测量中，哮喘患者（表2）呼出的NO的浓度均较高。哮喘患者的受阻呼出NO浓度显著高出（30126 ppb）对照组（783 PPB，P 0.001），与之前采用相同呼吸方法测定时的记录相比，两组没有显著的变化（8）（图1）。与非哮喘患者相比，哮喘患者在呼气结束时（终期NO，顺畅呼吸）测定的NO值（466 ppb），与肺泡CO2的变化同步，均高于非哮喘个体（71 ppb，P 0.001;图2）。受阻呼出的NO值或终期顺畅呼出的NO值，与FEV1 或 PC20之间都不存在相关性。屏息20秒后，测到的初始峰值NO，哮喘患者明显高出（表2）。初始峰值浓度明显与受阻呼吸的呼出NO相关（正常人 r = 0.6，哮喘患者 r = 0.5，P 0.01）。在呼气末期，NO的浓度下降到一个值，与未屏息时，采用同样呼气方式测定的数值差别不大（图3）。鼻腔一氧化氮浓度鼻腔NO浓度的测定值，是在屏息状态测出，并通过CO2的缺失进行确认的（图4）。与正常人（99639 ppb，P0.002）相比，哮喘患者（1,39071 ppb）明显高出。无论是正常人，还是哮喘患者，鼻腔NO浓度与受阻终期呼出NO或通畅呼出时的NO之间均没有相关性。哮喘患者和正常人之间的NO百分比差异，在鼻腔NO（408，P 0.05）值上最小，而在顺畅呼吸的终期时最大（557 85, p 0.001）。下呼吸道的一氧化氮浓度支气管镜检查前，患者和对照组呼气的NO浓度，接近主要的被研究人群（表3）。与对照组(9 1 ppb; p 0.01)相比，哮喘患者组在顺畅呼出时的NO值（4611 ppb）有明显差异。哮喘患者通过纤维支气管镜在气管（3912 ppb）和右中叶（3912 ppb）测得的NO浓度，明显高于非哮喘受试者（41 ppb，气管，42 ppb，右肺中叶，p0.01，图5）。哮喘患者中，纤维支气管镜测量前测到的终期呼出NO浓度，与在气管和右中叶测出的NO浓度相近。但在对照组中，气管和右中叶值的NO浓度均明显低于终期呼出值。终期呼出NO值与气管（r= 0.91，P 0.0001）及右肺中叶（r =0.87，P0.0001）测出的NO值有很强的关联性（图6）。讨论我们已经研究了正常及哮喘人呼出空气中NO的来源，以澄清呼出气体中NO含量的正确解释。我们的研究结果证实，采用呼吸方式在测量起到重要作用，并提供证据，说明哮喘患者呼出气体中NO浓度的增加，绝大部分源自下呼吸道。受阻缓慢呼气时，由于低流量(约1 L/min)，导致正常个体（783 ppb）的NO值（峰值呼出的NO）接近我们之前按类似呼吸方式，使用不同的NO分析仪（80 4 ppb, n = 67）时的测出值。相反，通过分析仪进行缓慢、低阻力呼吸，以及通过侧臂抽样分析获得的值，则要低得多（71 ppb），这与以前报告的，以波动呼吸（13）和使用气相色谱 - 质谱法测试所获得的结果相一致（6） 。屏息20秒导致的NO峰值，可能反映了来自鼻咽和气管的NO。但其浓度在之后有所下降，呼气末期的值与不屏息，顺畅呼吸时获得的值接近。两种不同呼气方式所产生的NO值差异，不太可能是由于呼气期间的鼻腔的污染所导致，更象是由于在测试开始前，对口中已污染残余气体的取样所致。研究两种不同呼气方式的流速，就会发现对两个数据差别的解释。在顺畅呼吸时，被测者以5 L/min的流速呼入气体到检测设备，因此，NO值可以更好地评估下呼吸道。我们的纤维支气管镜检查测量验证了这种测量的有效性。同时记录的呼出二氧化碳浓度，证明呼出的NO浓度在整个呼出过程中持续较高，而CO2的浓度则只是在最后上升。这表明，NO可能来自整个下呼吸道，而不仅是肺泡。鼻腔中的NO浓度（约1,000 ppb）比呼出末期时高出100倍，比记录的峰值高出10倍。之前有报道称，对正常人的鼻腔进行直接取样获得类似结果（12-14）。通过检查取样过程中CO2 的缺失，我们证实鼻腔中的直接取样并未受到来自下呼吸道的污染。鼻腔空气中较高NO的来源无法确定，但最近的研究表明，鼻窦会产生高浓度的NO，这可能会扩散到鼻腔（16）。我们发现与正常人相比，哮喘患者的NO浓度显著升高。所有哮喘患者都有过敏性，并可能伴随由嗜酸性粒细胞导致的过敏性鼻炎，并由炎症产生诱导型一氧化氮合酶。然而，所有哮喘患者在研究过程中，均未发现有症状的鼻炎，而且所有测试都在没有花粉的季节开展。最近，反映鼻液中内源性NO生成的亚硝酸盐+硝酸盐浓度的测量，表明在正常和鼻炎个体中有类似的浓度，且不受外用类固醇的影响，表明鼻源性NO可能不是源自诱导酶，其诱导作用可能被糖皮质激素（17）所抑制。我们发现，哮喘患者呼出的空气中的NO含量明显高于非哮喘患者，此前的研究也反映了同样的事实（7-9）。无论是呼出NO峰值（30126 ppb），还是末期呼出值（466 ppb），均有所高出。 我们在鼻腔NO含量与受阻呼出的NO浓度，或顺畅呼出的NO浓度之间没有发现相关性，表明表明哮喘患者呼出NO浓度的升高并不只是鼻腔作用的反映。正常和哮喘患者之间，在顺畅呼吸情况下末期呼出NO浓度值的差异，大于受阻呼吸时。这可能表明，末期呼出值更好地反映了来自下呼吸道的NO浓度。表三正常及哮喘患者的呼出、鼻腔和下支气管值呼出及鼻腔NO浓度值（ppb）气管NO浓度值（ppb）受阻呼出峰值顺畅呼吸末期值屏息峰值呼出屏息末期呼出鼻腔NO (ppb)气管RML正常人 n = 579 49114 191892 304142哮喘患者n = 10243 27t46 11+173 24t59 15+1,313 102t39 12+39 12+简语定义： ppb =parts per billion; RMl = 右肺中叶。* 数据为平均 SEM .t p 0.001 (ANOVA), 与对照组有明显不同:I: p 0.002 (ANOVA), 与对照组有明显不同直接证明哮喘患者呼出NO浓度上升源自下呼吸道的证据，来自气管和右中叶支气管采样测量中NO含量的增加。的确，在呼气末期测量的NO浓度，与气管和支气管中测量到的值之间，有着密切的关系。在支气管和气管之间没有明显的梯度，这可能表明NO形成于整个下呼吸道。通过支气管镜，在15至20秒的屏息（即，无呼气动作）期间，对气管和支气管的NO浓度进行测量。由于在气管插管状态下，无法在呼吸末期进行测量，我们在直视情况下将套管送于支气管，测到了峰值NO量。至于受阻末期呼出NO浓度，曲线下的区域与峰值NO有高度的相关性。下呼吸道中NO的细胞学来源尚不能确定。利用灌注猪肺进行的研究表明，呼出的NO源于肺泡表面，而不是肺循环（18）系统，并且可能衍生自以正常肺组织中的肺泡壁（19）存在的内皮一氧化氮合酶。呼吸道上皮细胞也可能代表着血管内皮型一氧化氮合酶（20）的一种形式。有证据表明，哮喘患者的呼吸道上皮细胞中，存在诱导型一氧化氮合酶（11）。炎性细胞因子会导致在人支气管上皮细胞培养体中出现诱导型一氧化氮合酶（21，22），很可能哮喘炎症会释放相同的细胞因子（23）。诱导型一氧化氮合酶可表现有其他类型的细胞，如肺泡巨噬细胞和其他炎性细胞，虽然这并未在近端呼吸道哮喘患者（11）的活检中检出。此外，糖皮质激素抑制上皮细胞中诱导型一氧化氮合酶（21）的诱导作用，这也许可以解释为什么接受吸入性类固醇治疗的哮喘患者拥有较正常的呼出NO浓度。事实上，口服和吸入糖皮质激素可降低哮喘患者呼出的NO浓度，（24，25），而口服强的松（30 mg 3天），对正常人（24）呼出的NO水平没有影响。我们还发现，在吸入性过敏原的后期反应中，哮喘患者呼出气体中的NO浓度增加，这可能反映了下呼吸道中一氧化氮合酶的诱导作用（26）。支气管扩张患者呼出的NO也会升高，并且，在NO提高程度和电脑断层值（27）测到的扩张程度之间存在一定的关联。与测得的仰角和支气管扩张的程度之间的相关性的程度。综合起来，可支持这样的观点，哮喘和支气管扩张中NO的升高，源自一氧化氮合酶的诱导，且这种诱导作用发生于下呼吸道中。我们的研究支持将测到的呼出NO浓度，作为监控下呼吸道的炎症的技术。自由呼吸状态最有利用观察正常人与哮喘患者之间的区别，并与通过支气管镜，对气管和肺叶支气管进行测量得出的结论有很好的关联。我们没有发现呼出的NO，在以可预测FEV1的特定百分比和气管响应进行测算时，与哮喘严重程度的关联，但参与本研究的所有哮喘病人，病情都不严重。有关呼出NO浓度与其他呼吸道炎症反应指标的关联，如炎症细胞在诱导痰和支气管活检方面的作用，还需要进一步研究。参考文献1. 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