5月13日 5月20日 Mitochondria and Plastids.ppt

MitochondriaandPlastidsmorphologydynamicsfunction inheritanceKnowledgenotyetincludedinthetextbooks 北京大学苏都莫日根sodmergn PartI morphologyanddynamics 光学显微镜下的线粒体 1890年Altmann 德国 D 0 3 1 m L 1 5 3 0 m 拟南芥分生细胞的三维重构照片 在细胞分裂的周期中 线粒体一度融合形成环核的片层状线粒体 蓝色 同时细胞中也保留常见的颗粒状线粒体 绿色 左图 G1 S期细胞 右图 G2期细胞 n 细胞核 紫色 Bar 2微米 图片来自Segui Simarroetal 2008中的Fig 7 有改动 DAPI Electronmicroscopy MitoTracker Conclusion Themorphologyandnumberofmitochondriaarehighlyregulatedinthecells Thisregulationmaintainsthepropershapeandcontentofmitochondriaincertaincells 线粒体的融合与分裂 a 洋葱表皮细胞内线粒体在51秒和69秒时间段内相继发生融合和分裂的荧光显微照片 实验使用可变色荧光蛋白 Kaede 标记线粒体 红色和绿色的颗粒为不同的线粒体 当它们融合后颜色叠加成为黄色 箭头指示融合发生 b 烟草悬浮培养细胞中的线粒体以及90秒和40秒时间段内线粒体发生分裂的荧光显微照片 实验使用MitoTracker red 标记线粒体 同时用SybrGreen标记线粒体DNA 在重合的照片中 红色和绿色两种荧光叠加出现的黄色荧光区域为线粒体拟核 DNA 所在的位置 注意在线粒体分裂过程中 线粒体DNA并不被均等分配 箭头指示没有拟核荧光的线粒体 Bar 2微米 图片来自Arimuraetal 2004中的Fig 2和Fig 4 有改动 模糊的葱头 与跨膜大分子GTPase Fzo 的模式结构 WT 野生型果蝇精细胞发育过程中线粒体融合形成的大体积球形线粒体 fzo 突变体中聚集但不融合的小线粒体 OM 线粒体外膜 IMS 膜间隙 IM 线粒体内膜 Bar 2微米 图片来自HalesandFuller1997中的Fig 1以及Westermann2003中的Fig 3 有改动 fuzzyonion 线粒体融合基因突变导致的线粒体片段化 a Fzo1基因野生型 WT 和突变体 fzo1 酵母细胞中的线粒体 注意野生型细胞中的线粒体长条状 突变体中变为颗粒状 b Mfn1基因野生型 上排 和突变体 下排 小鼠细胞内的线粒体 注意野生型细胞中蓝色标出的细长线粒体在相对运动中接触并融合 而突变体细胞中的线粒体高度片段化 无规则运动和融合现象发生 Bar 3微米 a 10微米 b 图片来自MozdyandShaw2003中的Fig 2以及Chenetal 2003中的Fig 4 有改动 线粒体分裂必需基因 Dnm1 Drp1 的作用及产物定位 a Dnm1基因野生型 WT 和突变体 dnm1 酵母细胞中的线粒体 注意野生型细胞中的线粒体长条状 突变体中变为网络状 b Drp1基因野生型 WT 和突变体 drp1 线虫细胞内的线粒体 注意野生型细胞中线粒体呈规则的条形 黄色 而突变体细胞中的线粒体发生彭大且由延伸成细线的线粒体外膜 绿色 相连 说明Drp1于线粒体分裂及分裂后期的膜切断必不可少 c 线虫细胞中Drp1的活细胞定位 上排荧光照片 线粒体标记为红色 Drp1标记为绿色 及dynamin纤维组装及分解驱动线粒体分裂的模式图 注意线粒体分裂的位点上出现Drp1 Bar 2微米 a 5微米 b 2微米 c上 0 1微米 c下 图片来自Mozdyetal 2000中的Fig 1 Labrousseetal 1999中的Fig 4和Fig 7 有改动 Conclusion Themorphologyandnumberofmitochondriaincellsareregulatedbywell balancedmitochondrialfusionsanddivisions Thefusionsanddivisionstakesplacefrequently allowingallmitochondriainacellasadiscontinuouswhole 电子显微镜下观察到的线粒体分裂装置 a 研究线粒体和叶绿体分裂装置的经典实验材料 红藻细胞的荧光显微照片 DNA特异性探针DAPI染色 及细胞内线粒体与叶绿体分裂模式图 红藻细胞含一个线粒体和一个叶绿体 在细胞增值过程中 叶绿体 红色自发荧光 率先启动分裂 随后线粒体启动分裂 最后细胞核分裂 红色的环状结构示线粒体和叶绿体的分裂环 b 电子显微镜下观察到的分裂环平环切面 在3张连续切面 黑白 叠加后生成的图片 彩色 上 可以同时观察到线粒体分裂环 大箭头 及叶绿体分裂环 小箭头 c 线粒体分裂环的垂环切面 在分裂环的断面上 可以观察到电子密度较高的外环 大箭头 及电子密度相对较低的内环 小箭头 Bar 1微米 a 0 5微米 b c C 叶绿体 M 线粒体 N 细胞核 图片来自Kuroiwaetal 1995中的Fig 1 Fig 3和Fig 4 有改动 红藻分裂环的分离及蛋白质鉴定 参见Yoshidaetal 2009CurrBiolinpress 光学显微镜及荧光显微镜下观察到的叶绿体 左图 拟南芥叶肉细胞原生质体 焦面置于细胞中部时 观察到的叶绿体呈两端渐窄的条形 上图中箭头 而将焦面移动到细胞顶部时 观察到的叶绿体为近圆形 下图中箭头 可见 叶绿体的立体结构应与凸透镜或铁饼相似 右图 将原生质体细胞质平铺并经DAPI染色后的荧光显微照片 红色为叶绿素的自发荧光 当细胞质平铺为一薄层时 叶绿体的顶面观均为近圆形 此外 经DAPI染色后的叶绿体中可以观察到叶绿体DNA颗粒状荧光 大箭头 同时 细胞质中可以观察到线粒体DNA的荧光信号 小箭头 N 细胞核 Bars 10微米 图片由北京大学胡迎春博士提供 CRUMPLEDLEAF CRL 编码一个质体外膜蛋白 突变影响质体分裂 形成超大的叶绿体 参见Asanoetal 2004PlantJ Conclusion Themorphologyandnumberofplastidsarehighlyregulatedinplantcells Thisregulationmaintainsthepropershapeandcontentofplastidsinthecells 电子显微镜下观察到的红藻 a b 及被子植物天竺葵 c 的叶绿体分裂环 在扫描电子显微镜下 红藻叶绿体分裂环的外环 a中双箭头指示 为一环形索状结构 位于叶绿体表面 随着叶绿体分裂的进行而变粗 在叶绿体的垂环切面上 分裂环的一对横切面出现在叶绿体的缢缩处 呈较高电子密度 b中双箭头指示 将分裂环的切面放大 b中下图 后 在外环切面 大箭头 的下面可以清楚地区分辨出形状宽扁的内环 小箭头 断面 外环与内环的断面之间由叶绿体膜相隔 高等植物的分裂环在超微结构上与红藻相同 随着分裂的进行 I III 分裂环外环 c中箭头指示 变粗 截面积增大 c中右图分别为左图的局部放大 CP 叶绿体 MP 线粒体 N 细胞核 Bar 0 5微米 a b上 c左 0 1微米 b下 c右 图片来自Miyagishimaetal 1999中的Fig 2 a Miyagishimaetal 1998中的Fig 4 b 以及Kuroiwaetal 2002中的Fig 2 c 有改动 天竺葵叶绿体分裂过程中的Z环 a 及拟南芥叶绿体分裂装置相关基因的突变表型 b 注意内环的免疫荧光在在叶绿体膜尚未发生缢陷的分裂早期最强 随着叶绿体分裂的进行而减弱 同时 与野生型 WT 相比 编码ARC5 ARC6 PDV1的基因突变 arc5 arc6 pdv1 1和pdv1 2 后叶肉细胞内出现大体积的叶绿体 Bar 1微米 a 10微米 b 图片来自Kuroiwaetal 2002中的Fig 1 a Miyagishimaetal 2006中的Fig 2以及Glynnetal 2008中的Fig 5 b 有改动 dynamin 被子植物叶绿体分裂装置的定位 在叶绿体分裂的早期 内膜下的Z环最先完成定位和组装 叶绿体内膜跨膜蛋白ARC6的N端伸向叶绿体基质 与FtsZ的相互作用 协助Z环组装 同时 ARC6的C端伸向膜间隙 与外膜跨膜蛋白PDV2的C端相结合 将叶绿体膜内的Z环位置信息传递到膜间隙 在PDV2的相同位置 还存在另一个C端较短跨膜蛋白PDV1 这两个蛋白的N端均伸向细胞质 共同招募ARC5 PDV1和PDV2的编码基因双突变后ARC5无法正常定位 而它们的单突变亦导致叶绿体分裂异常 引自Glynnetal 2008中的Fig 7 FtsZ 叶绿体及原质体膜向外延伸形成的柔性管状结构 箭头指示 该结构具双层膜 分别为叶绿体内膜和外膜的直接延伸 由于叶绿体 或质体 基质随小管延伸 基质小管故而得名 stroma filledtubule stromule a 光学显微镜下叶绿体表面出现基质小管的连续过程 b GFP标记叶绿体膜后荧光显微镜下观察到的基质小管 c 三维重构显示的拟南芥卵细胞原质体及复杂的基质小管网络 CP 叶绿体 PP 原质体 Bar 10微米 a b 2微米 c 部分图片来自Kohleretal 1997中的Fig 3以及Ishidaetal 2008中的Fig 5 有改动 Conclusion Thevolumeandnumberofchloroplastsareregulatedbyplastiddivisionsduringearlyleafdevelopment Plastidfusionisnotobserved However stromuleprovidesdynamicconnectionsbetweenplastids allowingallplastidsinacellasalsoadiscontinuouswhole 光照强度对叶绿体分布及位置的影响 野生型 WT 拟南芥叶片呈深绿色 对叶片的一部分 整体遮光 中部留出一条窄缝 强光照射1小时后 被照射的窄缝处变成浅绿色 这是由于细胞中的叶绿体发生了位置和分布的变化 以减少强光的伤害 叶绿体通过位移避开强光的行为称为躲避相应 avoidanceresponse 相反 在光照较弱的情况下 叶绿体会汇集到细胞的受光面 这种行为称作积聚响应 accumulationresponse 在一种叶绿体定位异常的突变体 chup1 中 光照对叶绿体的位置和分布式去影响 箭头指示光照的方向 小箭头 弱光 大箭头 强光 部分图片来自Oikawaetal 2003中的Fig 1 有改动 Chup1 chloroplastunusualpositioning1 Chup1 叶绿体外膜蛋白 与actin结合 Developmentofchloroplasts var2variegationserveasaquiteextremecaseforplastidvegetativelineage butunusualfornaturalgreenplants 叶绿体分化及分化异常的表现 在烟草中 叶绿体基因atpA的RNA编辑异常可引起植株白化 WAT 9 野生型拟南芥 WT 叶肉细胞中原质体分化为叶绿体 而花叶突变体 var2 叶片白斑部分的叶肉细胞内质体形成白色体 绿色区域内质体形成正常的叶绿体 植物的花叶突变体在园艺中常被视为珍稀观叶品种 其变异的分子生物学机理多数不祥 unknown示一种未知变异机理的常春藤花叶突变体 Bar 2微米 部分图片 WAT 9 来自Schmitz Linneweberetal 1995中的Fig 2 有改动 其它图片由由北京大学张泉博士 胡迎春博士及日本冈山大学W Sakamoto博士提供 PartII function Nojietal 1997 The subunitrotatesinananticlockwisedirectionwiththerotarytorqueatmorethan40pN nm nature DirectobservationoftherotationofF1 ATPase 线粒体的生物化学氧化磷酸化 oxidativephosphorylation 电子传递链 核质冲突nuclear cytoplasmicincompatibility 光反应 电子传递 暗反应 碳同化 合成ATP 使用ATP PartIII inheritance M jalapa P zonale Non MendelianGenetics CarlCorrens 1864 1933 ErwinBaur 1875 1933 biparentalinheritance maternalinheritance 探索合子和雄配子体调控机制的分子生物学机理 MitochondrialDiseases 人类 13个蛋白质85种疾病脑坏死 心肌病 肿瘤 不育 帕金森 CMS 拟南芥 122个蛋白质 非孟德尔遗传 mitochondria Egg Sperms Thespermcellistoosmalltocontainmitochondria Thespermmaycontainafewmitochondriabutthesemitochondriaremainoutsideofthezygoteatfertilization R Dawkins Whymaternal Chlamydomas mating 5minaftermating FromKuroiwaetal 1982 Maternalinheritanceofplastid A andbiparentalinheritanceofmitochondrial B inCucumismelo FromHaveyetal 1998 5 0 x10 5 50 mtDNA copies cell 1 0 x10 3 Egg Sperm Somatic Maternalinheritancewithpaternalleakageat1 0 x10 4 FromShirataetal 2000 Hechtetal 1984 Cummins1998 Gyllenstenetal 1991 Additionalspermmitochondria ifintroducedtothefertilizedeggsbymicroinjection resultinremarkablepaternaltransmission 500foldduplicated 20folddeclined Digestionofspermmitochondriainthezygote Ubiquitinationofmalemitochondria Ubiquitinatedprohibitinasaproteolyticmarker FromThompsonetal 2003 Conclusion Itisnotthesmallnessofspermcellthatdeterminesmaternalinheritance TherelativeinputsofspermandeggmtDNAarecriticalformitochondrialinheritance Anubiquitin mediateddegenerationofspermmitochondriaissuggestedtoactasatriggerformaternalinheritance Non Mendeliangenetics nogenes nomutants Inplants thefirststepistounderstandhoworganelleinheritanceisregulatedatthecellularlevel DegradationofmalemtDNAformaternalinheritance Isolationofgameticcellsforsingle cellPCRtodeterminethecopynumberofmtDNA TargetSequences maturasecoxI CompetitivePCR sensitive competitive APCRtestusingArabidopsismesophyllchloroplasts MitochondrialDNAisnotamplifiedintheeggcellsofA thaliana A majusandN tabacum ThespermcellsofA thaliana A majusandN tabacumcontainlessthan1copyofmtDNA WhereasthecellsofC meloandP zonalecontainmorethan200copies Maledetermines Mesophyllcell 670mt 61 7mtDNA0 092copies mt 1 11 Eggcell 759mt 59 0mtDNA0 078copies mt 1 13 Spermcell 9and15mt 0 083mtDNAdegradation SimilaritybetweeneggandsomaticcellsInsufficiencyofmitochondrialgenomes Conclusion TheeggcellofangiospermmaintainsmtDNAequivalentinamounttoasomaticcell MitochondrialinheritanceseemstobedeterminedbyunilateralregulationsofspermmtDNA 0 47copies Down regulation when how 基础知识 花粉发育及精细胞线粒体DNA上下调 非孟德尔遗传现象发现与1909年 实验表明被子植物精细胞线粒体DNA的上下调是调控线粒体遗传方式的决定性因素 A30 folddown regulationofmtDNA 482 7 16 0 occursinthepollensofA majus AnearlygenerativecellofA majusmaycontain23 4copiesofmtDNA 482 7 20 6 Comparedto0 47copiesdetectedfromthematuregenerativecell itappearsa50 folddegradationoccursingenerativecell C melo P zonale DuplicationofspermmtDNAinC meloandP zonale DNA结合蛋白可抑制线粒体DNA的下调 DNA结合蛋白 Conclusion Themalegameteplaysacriticalroleinregulatingmitochondrialinheritanceinangiosperms MolecularmechanismscontrollingmtDNAlevelsinthemalegameteareimportantmechanismsofmitochondrialinheritance DNase DNApolymerase Tfam Abf2p helicase Plastidinheritance Distributionofplastidsduri