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果蝇实验报告 班级：生物技术 实验者：王茜 同组人员：谢京合一、实验目的1. 通过实验验证分离规律、自由组合规律、伴性遗传和连锁互换规律，掌握果蝇杂交的实验技术和基因定位的三点测验方法，在实验中熟练运用生物统计的方法对实验数据进行分析。2. 练习分离果蝇幼虫唾腺的技术，学习唾腺染色体的制片方法。3. 观察了解果蝇唾腺染色体的形态学及遗传学特征。二、实验原理1.果蝇培养原理果蝇（fruit fly）是双翅目（Diptera）昆虫，属果蝇属（genus Drosophila），约有3000多种，我国已发现800多种。通常用作遗传学实验材料的是黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。用果蝇作为实验材料有许多优点：1. 饲养容易。在常温下，以玉米粉等作饲料就可以生长，繁殖。2. 生长迅速。十天左右就可完成一个世代，每个受精的雌蝇可产卵400500个，因此在短时间内就可获得大量的子代，便于遗传学分析。3. 染色体数少。只有4对。4. 唾腺染色体制作容易。横纹清晰，是细胞学观察的好材料。5. 突变性状多，而且多数是形态突变，便于观察。果蝇的生活史：果蝇的生活周期长短与温度有密切关系。一般来说，30以上温度能使果蝇不育或死亡，低温能使生活周期延长，生活力下降，饲养果蝇的最适温度为2025。生活周期长短与饲养温度的关系10152025卵幼虫幼虫成虫57天18天8天6天5天4天果蝇在25时，从卵到成蝇需10天左右，成虫可活2633天。果蝇的生活史如下：雌蝇 减数分裂 卵受精雄蝇 减数分裂 精子 第一批成虫羽化（第八天）（可活2633天） 产第一批卵蛹（第四天）第二次蜕皮 第一批卵孵化（第二天） （第零天）第一次蜕皮 幼虫（第一天）果蝇的生活周期和各发育阶段的经过时间果蝇的性别及突变性状的鉴别：果蝇的每一体细胞有8个染色体（2n=8），可配成4对，其中3对在雌雄果蝇中是一样的，称常染色体。另外一对称性染色体，在雌果蝇中是XX，在雄蝇中是XY。果蝇的雌雄在幼虫期较难区别，但到了成虫期区别相当容易。雄性个体一般较雌性个体小，腹部环纹5条，腹尖色深，第一对脚的跗节前端表面有黑色鬃毛流苏，称性梳（Sex combs）。雌性环纹7条，腹尖色浅，无性梳。实验中选用的果蝇突变性状一般都可用肉眼鉴定，例如红眼与白眼，正常翅与残翅等。而另一些性状可在解剖镜下鉴定，如焦刚毛与直刚毛等。现列表如下：实验中使用的果蝇突变品系影响部分突变名称基因符号染色体上座位翅眼色体色刚毛翅形残翅白眼黑体焦刚毛小翅vgwbsnmIIR 67.0X 1.5IIR 48.5X 21.0X 36.1焦刚毛的基因座为sn3, 本文简写为sn。2.果蝇杂交原理（1）野生型果蝇为红眼、灰身、长翅、直刚毛，与这些性状对应的突变性状很多，其中灰身（+）与黑身（b）是一对相对性状，且灰身对黑身为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上。用具有这对相对性状的两纯合亲本杂交，性状的遗传行为应符合分离定律。（2）黑体果蝇的体色为黑色（b），与之相对应的野生型果蝇的体色为灰色（+），灰色对黑色为完全显性，控制这对相对性状的基因位于第二号染色体上；果蝇另一突变性状为焦刚毛（sn），与之对应的野生型性状为直刚毛（+），控制这对相对性状的基因位于第一号染色体上，直刚毛对焦刚毛为完全显性。用具有这两对相对性状的纯合亲本杂交，其性状的遗传行为应符合自由组合定律。（3）生物某些性状的遗传常与性别联系在一起，这种现象称为伴性遗传（sex-linked inheritance），这是由于支配某些性状的基因位于性染色体上。果蝇属XY型生物，共有四对染色体，第一对为性染色体，其余三对为常染色体。雌果蝇的性染色体构型为XX，、雄果蝇为XY。控制果蝇眼色的基因位于X染色体上，在Y染色体则没有与之相应的等位基因。将红眼（+）果蝇和白眼（w）果蝇杂交，其后代眼色的表现与性别有关。而且，正反交的结果不同。（4）不完全连锁基因在形成配子时，随同源染色体非姊妹染色体单体之间发生交换而交换，产生一定频度的重组型配子，在子代中表现一定比例的重组性状，通过观察和统计测交子代各种表型的个体数，可估算出连锁基因间的交换率，由此确定基因在染色体上的相对位置，绘制出连锁遗传图。已知果蝇（Drosophila melanogaster）的红眼（+）对白眼（w）是显性，直刚毛（+）对焦刚毛（sn）是显性，长翅（+）对小型翅（m）是显性，控制这三对相对性状的基因都位于X染色体上，若将白眼（w）、焦刚毛（sn）、小型翅（m）三隐性突变体雌蝇（Xw sn mXw sn m）与红眼（+）、直刚毛（+）、长翅（+）野生型雄蝇（X+Y）杂交，则F1可产生三杂合体雌蝇（Xw sn mX+）和三隐性雄蝇（Xw sn mY）。由于Y染色体上不携带相应的等位基因，因而表现出X染色体上三个隐性基因所控制的性状，相当于一个三隐性纯合体。用F1代杂交（相当于测交）,F2代表现出的8种表型及数目与F1雌蝇产生的8种配子及数目一致，通过观察和统计F2代（相当于测交子代）8种表型的个体数，就可估算出这三对基因间的交换率，由此确定这三对基因其在染色体上的相对位置，绘制出连锁遗传图。3.果蝇唾腺染色体标本制备原理本世纪初，D. Kostoff用压片法首先在D. melanogaster 果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别巨大的染色体唾液腺染色体（salivary gland chromosome）。事实上，双翅目昆虫（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期都具有很大的唾腺细胞，其中的染色体就是巨大的唾液腺染色体。这些巨大的唾液腺染色体具有许多重要特征，为遗传学研究的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因差别表达等提供了独特的研究材料。双翅目昆虫的整个消化道细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而停止在分裂间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍不断地进行自我复制而不分开，经过许多次的复制形成约10004000拷贝的染色体丝，合起来达5mm宽，400mm长，比普通中期相染色体大得多（约100150倍），所以又称为多线染色体（polytene chromosome）和巨大染色体（giant chromosome）。唾液腺染色体形成的最初，其同源染色体即处于紧密配对状态，这种状态称为“体细胞联会”。在以后不断的复制中仍不分开，由此成千上万条核蛋白纤维丝合在一起，紧密盘绕。所以配对的染色体只呈现单倍数。而唾液腺染色体形成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚在一起形成一染色中心（chromocenter），所以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出的染色体臂。由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期状态，所以每条核蛋白纤维丝都处于伸展状态，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现深浅不同，疏密各异的带（band）。这些带的数目、位置、宽窄及排列顺序都具有种的特异性。研究认为这些带与染色体上的基因有一定关系，而一旦染色体上发生了缺失，重复，倒位，易位等，也可较容易地在唾腺染色体上观察识别出来。可见唾腺染色体技术是遗传学研究中一项基本的技术。三、实验材料1.不同品系的黑腹果蝇。2.黑身果蝇（b）：黑体、红眼、长翅、直刚毛（bb + + +）品系；三隐果蝇：灰体、白眼、小翅、焦刚毛（+ ww snsn mm）品系。3.D.virilis果蝇三龄幼虫。四、实验用具、药品1. 果蝇饲料的配制果蝇是以酵母菌作为主要食料的，因此实验室内凡能发酵基质，都可用作果蝇饲料。常用的饲料有玉米饲料、米粉饲料、香蕉饲料等。配方如下表：果蝇饲料的几种配方玉米饲料米粉饲料香蕉饲料水（毫升）琼脂（克）蔗糖（克）香蕉浆（克）玉米粉（克）米粉（克）麸皮（克）酵母粉（克）丙酸（毫升）10008809626100210881.41501.6501.40.511）玉米饲料：i)取应加水量的一半，加入琼脂，煮沸，使充分溶解，加糖，煮沸溶解。ii)取另一半水混和玉米粉，加热，调成糊状。iii)将上述两者混和，煮沸。以上操作都要搅拌，以免沉积物烧焦。iv）待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，分装。按附表用量配制，可得饲料1000毫升左右。2）米粉饲料：方法与玉米饲料相同，用米粉代替玉米粉。3）香蕉饲料：i)将熟透的香蕉捣碎，制成香蕉浆。ii)将琼脂加到水中煮沸，使充分溶解。iii)将琼脂溶液加入香蕉浆，煮沸。iv）待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，分装。丙酸的作用是抑制霉菌污染，用量参照附表，每200毫升饲料约加1.5毫升左右。如无酵母粉，也可用酵母液代替，但用法不同。若用酵母菌液则在饲料分装到培养瓶中以后再加入，每瓶加数滴。2.培养瓶培养果蝇用的培养瓶可用牛奶瓶，或大、中型指管，用海棉或纱布包的棉花球作瓶塞。实验室中保存原种以及杂交实验以中指管为宜。培养瓶用前要消毒，而后再装饲料（每瓶2厘米厚即可），待饲料冷却后，用酒精棉花擦瓶的内壁，然后插入消毒过的吸水纸，作幼虫化蛹时的干燥场所。3. 双筒解剖镜，镊子，解剖针，毛笔，白瓷板，吸水纸，培养箱，饲养瓶，麻醉瓶，乙醚，酒精，丙酸，培养基等。五、实验方法及步骤(一)果蝇培养1. 麻醉对果蝇进行检查时，用乙醚麻醉，使果蝇处于昏迷状态。使用时将乙醚（23滴）滴到麻醉瓶的棉花球上（注意不要让乙醚流进瓶内），麻醉瓶要保持干燥，否则会粘住果蝇翅膀，影响观察。麻醉果蝇时，先将长有果蝇的培养瓶在海棉垫上敲，使果蝇全部震落在培养瓶底部，然后迅速打开培养瓶的棉塞，把果蝇倒入去盖的麻醉瓶中，并立即盖好麻醉瓶，待果蝇全部昏迷后，倒在白瓷板上进行观察。果蝇的麻醉程度看实验要求而定，对仍需培养的果蝇，以轻度麻醉为宜。但对不再培养，单单进行性状观察的果蝇可以深度麻醉，甚至致死也无妨（果蝇翅膀外展45角，说明死亡）。检查完毕后，把不需要的果蝇倒入盛有煤油或酒精或水的瓶中（死蝇盛留器）。2. 果蝇交配将雌雄果蝇放在一起培养，雌蝇的生殖器中有贮精囊，可保留交配所得的大量精子，雌蝇一次交配所得的精子，足够它多次排出的卵受精，因此在做杂交试验时，雌蝇必须选用处女蝇（没有交配过的雌蝇）。雌蝇孵出后12小时内不会交配，这个时间内把果蝇全部倒出，分出雌雄蝇，单独饲养，这时收集的雌蝇是处女蝇。杂交时把所需品系的雄蝇直接放到处女蝇培养瓶中，贴好标签，注明两亲本的基因型及交配日期，进行培养。78天后倒掉亲本（一定要倒干净，以免亲代和子代混淆），待F1成蝇羽化后开始计算，观察性状。可靠的计数及观察是培养开始的20天以内（再晚F2也可能有了）。若须继续实验，观察F2，可在F1内挑出雌雄数对，另外培养，因为这次是用F1作亲本，进行个体间互交，所以这时不是处女蝇也可以。但如要把F1雌蝇与另一品系雄蝇杂交时，还要严格地选取处女蝇，方法同上。3. 原种培养在作新的留种培养时，应事先检查一下果蝇有没有混杂，以防原种丢失。亲本的数目一般每瓶510对，移入新瓶时，须将培养瓶横卧，然后用毛笔将麻醉的果蝇从白瓷板上轻轻扫入，待果蝇醒过来后再把培养瓶竖起，以防果蝇粘在饲料上。原种每24周换一次培养基（依温度而定，1015约4周换一次，2025约二周换一次）。每一原种培养至少保留两套，培养瓶的标签上要写明突变名称，培养日期等。作原种培养温度可控制在1015，培养时避免日光直射。果蝇在适宜条件下会产子代，在肉眼能看到幼虫时就可把亲本倒掉，几天以后，新的成蝇便产生。待成蝇有了足够保种的数量后，要调换培养瓶，作为下一代的亲本，继续培养。原种果蝇培养遇到的麻烦是饲料发霉。发霉的原因很多，如用具没有灭菌，空气污染，亲本不及时倒掉，都会引起饲料发霉。严重的霉菌污染会影响果蝇的生长。饲料中加丙酸可以抑制霉菌，但并不能完全制止。发现培养瓶中有少量霉点时可用烧过的解剖针挑出。若大量霉菌污染，可把果蝇全部倒在一个消毒过的空指管中，让它活动23小时，换一支指管，再活动12小时，而后倒入一支新的培养瓶中继续培养，这样可以防止霉菌污染。原种保存遇到的另一个问题是混杂，几个不同品系的果蝇在一起培养，一定要防止混杂。培养瓶的塞子要做得紧些，不使果蝇逃出。调换培养瓶时，要防止果蝇飞散。外逃的果蝇要打死。发现了混杂的原种，要根据原种果蝇的全部特征，挑出数对雌雄蝇饲养，进行筛选直到完全没有分离为止。这样做，费时费力，只是在不得已时才采用。一般混杂时，只要方便，可以重新引种，将混杂种弃去。（二）.果蝇杂交1.果蝇的性状观察、性别鉴定及饲养。2.选取杂交亲本中所用的母本必须是处女蝇。刚羽化的雌蝇在12h内一般无交配能力。在杂交前放出亲本培养瓶中的所有成蝇，每隔1012h收集一次羽化的成蝇，并将雌雄蝇分开饲养。收集处女蝇数量的多少根据需要而定。3.麻醉接种 用黑身果蝇与三隐果蝇杂交，正反交同时进行。即三隐黑身，黑身三隐。将所选处女蝇按品系分别麻醉，按不同杂交组合分别选取雌、雄蝇各610只移入杂交瓶中，为了防止昏迷果蝇被培养基粘住，可将培养瓶放倒，将果蝇置于瓶壁，待其苏醒后再将培养瓶直立，贴上标签：反交bb X+ X+ BBXw-m-snY日期：姓名：正交BBXw-m-snXw-m-snbbX+Y日期：姓名：将杂交瓶放在2025恒温箱内培养。4.培养78d，倒掉杂交亲本（倒掉的果蝇最好处死）。5.再过45d，F1代成蝇出现，观察F1代性状是否和预期结果一致。6.收集610对F1代果蝇放入一新培养瓶，在2025恒温箱内继续培养，以便观察F2代（正反交作相同处理）。7.继续培养78d后，移去F1代。8.再45d，F2代成蝇出现，开始观察并统计F2代的性状表现类型及数目。（三）唾腺染色体制片1.检查幼虫培养瓶，取一适龄幼虫，置于载玻片上，并加上一滴生理盐水（如幼虫带有饲料可先用生理盐水洗净），置双筒解剖镜下检查。首先熟悉幼虫结构，幼虫具一钝尾和带黑色口器的尖头端。2.在解剖镜下用两支解剖针，一针压住头部，压点尽可能靠头部口器处。因为幼虫会蠕动，这一步需先练习几遍。3.幼虫头部固定之后，再用另一针压住尾端（或用尖头镊子夹住），平稳快速一拉，使口器部分断开，体内各器官也从切口挤出，一对唾腺也随之而出。唾腺是一对透明的香蕉状腺体，仔细观察可发现由一个个较大的唾腺细胞组成。4.分离的腺体可能伴有消化道和脂肪体。在载玻片上再加一滴生理盐水，确定取得了腺体后，再用刀片或镊子仔细剔除这些杂物，仅让腺体留下。或将腺体吸到干净玻片上。5.用滤纸将多余的生理盐水吸去，注意不要碰着腺体，以防吸走。然后滴一滴1N盐酸解离58分钟.6.吸去多余盐酸，滴加改良的苯酚品红染液染色510分钟。7.染色后，盖上盖玻片，用滤纸轻轻吸去多余染液，然后放平在桌面，用大拇指压下盖片，可横向揉几下（注意不要使盖片滑动，且只朝一个方向揉动，不要来回揉！），多练习几次，可望获得分散良好的制片。8.制好的压片即可在显微镜下观察。亦可制成永久制片，步骤如下：置酒精：冰醋酸（3：1）固定液中固定，待盖片脱落后，再将有材料的载玻片和盖玻片通过下列顺序：95%酒精1分钟，纯酒精1分钟，再经纯酒精1分钟，取出载玻片，加一滴优巴拉尔（euparal）光学树胶，再取出盖玻片盖下，即可。六实验结果统计正 交灰体黑体合计红、长、直 162904839339白、小、焦 72943017213白、长、直 25239663红、小、焦 12186844红、长、焦 532010白、小、直 21115红、小、直 20274758白、长、焦 19255352体色合计598186784性别合计31728110581性别合计422362反 交灰体黑体合计红、长、直 34911411135609白、小、焦 991218120白、长、直 5201430红、小、焦 9100019红、长、焦 04026白、小、直 06017红、小、直 16266856白、长、焦 2221429体色合计683193876性别合计39029312172性别合计511365七实验结果讨论一连锁遗传图谱表现型本组数据实验结果+ + +948 亲本型w m sn333w + +93 单交换1+ m sn63+ m +114 单交换2w + sn 81+ + sn16 双交换w m +12有实验结果统计可得，+ + sn 和w m + 的数量是最少的，所以可以得到这个是双交换的产物。则由实验数据求算重组率：RF（w-m）=93+63+114+81/1660 *100% =21.14%RF (w-sn)=93+63+16+12/1660 *100% =11.08%RF (m-sn)=114+81+16+12/1660 *100% =13.43%则由此得到遗传连锁图谱：W-Sn-M-11.08-13.43- -21.14-二分离定律灰体：黑体=（598+683）：（186+193）=1281：379=3.38：1结果分析：由以上分析可得，计算所得数据和理论数据偏差较大。产