5第五章 细菌的遗传分析.doc

第五章 细菌的遗传分析 教学基本要求： 1熟练掌握细菌遗传分析的有关内容，如细菌的杂交；因子；高频重组；用中断杂交技术作连锁图；大肠杆菌的染色体呈环形；F因子整合到细菌染色体的过程；细菌的交换过程；重组作图；性导；三种不同的致育因子的相互关系。2理解转化与转导作图的原理，学会实验数据的分析方法。 学时数：4学时 第一节 细菌的细胞和染色体 原核细胞与真核细胞的区别： 1、原核细胞没有核膜，也没有细胞核，只有染色体区，称拟核区；真核细胞具有细胞核，染色体与细胞质分开。 2、原核细胞的染色体是一条裸露的DNA分子，DNA含量校真核细胞少得多，较易插入DNA片断。 3、原核细胞没有线粒体、质体等细胞器。 4、转录和翻译无论在时间上还是空间上都难以分开。 5、原核细胞一经分裂就相互分离，呈单细胞状态。20分钟一代。 共同性: 遗传物质都是核酸，传递信息的密码子是相同的。 原核细胞如 细菌、藻类、支原体。第二节 大肠杆菌的突变型及筛选 一、营养缺陷型 在营养代谢上是有缺陷的，统称为营养缺陷型，而把正常的野生型叫做原养型。 原养型细菌对培养基中的营养成分要求很简单，只要求有葡萄糖和一些无机盐就能生活。这种能保证野生型生活的最低限度的培养基叫做基本培养基。 而营养缺陷型由于基因空突变，丧失了自己制造某种物质（氨基酸，维生素。嘌呤或嘧啶等）的能力，所以在营养代谢上产生了特殊的要求，只有在基本培养基中补加了它们所不能合成的某些物质，才能使营养缺陷型正常生长。这种补加了一定营养物质的基本培养基叫做补充培养基（additive medium）。 完全培养基。 1、合成代谢缺陷型 ：不能合成细菌生长所需要的物质。(1)鉴别：(2)基因型的表示：用它们不能合成的物质的前三个字母来表示印迹法（印章法）简介2、分解代谢缺陷型： 如不能发酵乳糖，阿拉伯糖，甘露糖，木糖，麦芽糖。 (1)鉴别： 如鉴别乳糖发酵缺陷型，在培养基上加伊红和美蓝这两种染料（EMB培养基），原养型菌落是红色，缺陷型为白色菌落。 选择培养基 ： 能把野生型和突变型明显地区别开来，使人们进行选择的培养基。 (2)基因型表示 lac-乳糖不能利用。 gal-半乳糖不能利用。 二、抗药型（resistant） 野生型细菌通常会被一定剂量的某种药物杀死，所以叫做药物敏感型（sensitive）。 1、鉴别 ： 在培养基中加入相应的药物，如青霉素，链霉素。 2、抗药机理 ： 敏感型细菌核糖体30S亚基的S12蛋白和链霉素结合，使翻译发生差错，或使翻译过程的启动作用失效。而抗药型S12变异，不不再和链霉素结合。青霉素抑制细胞壁的形成。 3、基因型的表示： 用该药物名称的前三个字母名称并在右上角附加r表示 抗药型，s表示敏感型。 如 Pens Penr 青霉素 strs strr 链霉素 azir azis 叠氮化钠 注意： 敏感型是野生型三、抗噬菌体突变型 1、原理：野生型细胞壁上有噬菌体的接受点（phage receptor stops）;而抗噬菌体突变型没有噬菌体的接受点。 2、鉴别 ： 噬菌斑。 3、基因型表示：对T1噬菌体抗性变突体Tonr或ton， 敏感型 Tons 或ton+ ， 同理T2噬菌体，Ttos ， Ttor。 4、噬菌体与细菌的关系侵染与抗性 第三节 大肠杆菌的性别 细菌的有性生殖（杂交）最初是在大肠杆菌中发现的。一、经典的杂交试验 Lederberg和Tatum（1046）用大肠杆菌K12的两个菌株A和B的杂交试验： A、B混合培养在完全培养基上过夜，然后离心培养物，把沉淀细胞涂布在基本培养基外，发现长出了菌落，频率10-7（在果蝇中是办不到的）出现了基因重组证实：Davis（1950）U型管试验。两个菌株不能直接接触，只能是培养液和营养物质可以通过。 因此，可以说，菌株A、B接触后，象高等的有性过程一样，发生了杂交。遗传物质有了交换，产生了新组合：野生型重组体。 但是，Lederberg Tatum 解释： 步骤(1)细胞融合（同宗配合）；(2)形成二倍体合子；(3)交换减数分裂 存在问题：两个亲本类型对它们的子裔的遗传贡献并不相同。有些基因组合丢失与典型的减数分裂不同。 本质的认识是从Hayes的一个意外的发现才逐渐清楚，Hayes证明大肠杆菌有性过程是异宗配合。二、遗传物质的单方向转移 Hayes实验1： 菌株A met-thr+leu+thi+ 菌株B met+thr-leu-thi- str处理A + 未处理B存活 有重组（与对照频率一样） 基本培养基 str处理B + 未处理A无存活 Hayes 解释 ：(1)str处理后，不能繁殖，只有另一方繁殖。(2)如果转移是双向的，两种杂交都全出现重组型，供体经链霉素处理后，不能分裂，但仍能转移基因，而受体未受处理，仍能分裂。所以接受转移过来的基因后，有可能在基本培养基上形成菌落。 所以，大肠杆菌中遗传物质的交换不是交互的。事实上，菌株B作为遗传物质的受体，菌株A作为供体。三、F质粒（F因子）的发现 1、Hayes实验2： Hayes偶然发现了A菌株的一个不育的突变型，具有下面的遗传特性： 可育Hayes的解释：大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fertility factor）或性因子（sex factor）决定的F因子，具有这种因子的能育品系记为F，相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F，相当于雌性。 F+细菌的表面有称作性伞毛（sex pili）的细长细毛，由此与F细菌接合，一旦接触后，伞毛发生改变，成为两细胞间的原生质通道细胞质桥或称结合管（conjugation tube），F+细胞的F因子通过接合管向F细胞转递： 使F变成F，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F细胞间的接合。2、F质粒 ： F因子就是F质粒。 质粒：是指染色体外的遗传物质。可以自主复制，并在细胞分裂时分配到子细胞中。 特性 ： (1)自主复制 (2)感染 感染性质粒。 F质粒是能独立增殖的环状DNA分子。图示。 F质粒的结构： (1)原点， 转移的起点 (2)致育基因：形成性伞毛的基因群 (3)DNA复制酶基因 (4)插入序列（配对区域）（insertion sequence， IS） 3、F质粒转移的过程：F+F-的过程图示：滚环式复制， 式。4、F+F的特点： (1)F质粒转移的频率高，1/10，使F-F+。 (2)而染色体转移频率低。10-7 。 (3)F+F+不发生接合。 因此，F+品系又称为低频重组品系（low frequency recombination）四、高频重组品系Hfr Cavalli（1951）和Hayes（1954）先后从能育的A品系中分离出两个新的品系，它们和B（F-）杂交，出现重组频率很高。比AF+BF-高出1000倍。这种品系称为高频重组品系Hfr（high frequency recombination）。 1、Hfr 的特点 ： (1)高频重组，染色体转移频率高， 1000 (2)F质粒转移频率低 FF很少或没有。 2、Hfr的形成及转移过程 图示： 配对整合接合接合管复制转移起点。3、Hfr和F+的联系和区别 联系：（1）都是雄性菌，含有F质粒 （2）整合 游离 区别：（1）前者高频重组，后者低频重组； （2）前者F质粒转移频率低，后者F质粒转移频率高； （3）前者F质粒整合，后者F质粒游离 4、附加体的概念，频率高的原因 可见，不同的基因进入受体细胞时间是不同的。位于前端的基因，首先进入，可以想象，基因间的距离越长，转移的时间间隔越长，因此，可以用基因转移的时间长短、顺序来表示基因在染色体上的图距即时间作图法。这要用中断杂交技术。第四节 中断杂交与重组作图 一、中断杂交实验原理与作图 Wollman 和 Jacob想了解Hfr品系在杂交时，什么时候把基因转移给F细菌，他们把两个品系进行杂交 Hfr：thr+ leu+ azir tonr lac+ gal+ strs F-：thr- leu- azis tons lac- gal- strr 问题1： 如何确定基因转移的顺序和时间?混合培养液进行通气培养，每隔一定时间取样，把菌液放入搅拌器内搅动以打断配对的接合管，使接合的细胞分开以中断杂交然后检查某一基因是否发生重组。 问题2：如何检出某一基因的重组子? 把中断杂交的细菌放在完全培养基上培养，显然供体、受体菌都能生长。影响检别，我们只需要把发生重组的重组子检出。这就必须有一个可供选择用的供体标记基因。这样可以认出重组子，如在基本培养基中培养选择thr+leu+重组子。这时thr+leu+为标记基因，可排除受体菌株，但供体菌还能继续存在。为了不选择供体细胞本身，供体细菌也应该带有一个特殊的标记，能使自己不被选择。例如供体菌对链霉素敏感，这样当结合体在含有链霉素的培养基上生长时，供体菌株就被杀死了。 因此，把中断杂交的细菌稀释接种到含有链霉素的基本培养基上，如能形成菌落，它的基因型必定是thr+leu+strr。因为只有这种重组子才能生长。并说明供体thr+和leu+已进入受体并发生重组。我们称在供体菌中被选择的基因thr+和leu+为选择标记，而始终不被选择的strs为反选择标记基因，而那些还没有进行选择检定的基因为非选择标记。 问题3：在发生重组的菌落中，如何检别非选择标记基因。 对每一时刻的重组thr+leu+strr的菌落影印培养接种到不同的培养基上（如乳糖lae+ 伊红红，gal+ 美兰红色）。记录重组子中每一非选择标记出现的时间、出现的频率和持续时间，得右图（Hfr的非选择标记基因进入F-所需的时间，以及根据非选择标记在各个时间出现的频率作图）。从图中可以看到，从Hfr菌株的基因在F-细菌中出现的开始，随着时间的增加，具有这一基因的菌落逐渐增加，直到某一频率为止。而且某一基因出现的时间愈早，它达到的频率愈高。 解释 ： 因为基因在染色体上，从染色体的一端开始，以线性方式按一定的时间顺序依次进入F-细胞，始端称为原点（origin）或0。显然，基因离开原点越远，进入F-细胞越迟。离开原点较远的基因，可能在转移过程停止以前，仍未转移，因而频率较低，达到的最高值也较小。 根据以上实验，如果以转移的时间单位（每分钟）作为基因间的距离单位，就可以作出Hfr染色体上的基因分布图。 如果杂交持续2小时，然后中断交配，就会发现一些细胞转变为Hfr。这说明致育因子是最后转移到受体，是染色体的最后单位。所以频率很低。 中断杂交技术（interrupted mating technique）：根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。二、环状的染色体 Wollman 和 Jacob用不同的Hfr品系进行了大量的中断杂交试验，并作出了基因的连锁图。 表Wollman 和 Jocob 提出假设 ： 大肠杆菌的染色体是环状的。 这是由于F因子插入环形染色体的不同位置以及配对方向不同而引起的（插入序列IS有极性） 图示， 因而有不同的转移起点和方向。三、细菌重组的特点 转移到受体中的染色体必须通过交换过程整合到受体的基因组中去。 重组的特点: 1、形成部分二倍体（partial diploid）或部分合子（merozygote） 2、只有偶数次交换才能产生平衡的重组子。 3、相反的重组子不会出现。图示：(1)单交换产生不平衡的线性染色体。 (2)双交换产生有活性的重组子和片段，片段以后在细胞分裂中失去，所以重组子不会出现。 四、重组作图的原理和方法 在中断杂交中，根据基因转移的先后次序，以时间为单位求出各基因间的距离，叫做时间作图法。如果基因间转移的时间在两分钟以内，用这种方法求得的基因间距离就不很精确可靠，重组作图是根据基因间重组率进行定位的。接合重组作图的特点：（与减数分裂生物的区别） (1)不用亲本类型 (i)无法区分，(ii)不重组将丢失。 (2)两对基因间的交换频率，必须在形成部分二倍体的条件下，计算重组率。 (3)部分二倍体如果不发生重组，无法鉴别。只有最后一个基因进入受体细胞，长并发生重组才能鉴别，即最后一个基因发生重组的条件下，计算两基因的重组率。 (4)接合重组不产生相反的重组类型。 例如根据中断杂交试验知 lac 和 ade 基因是紧密连锁的而且 lac 比 ade 先进入受体。 试验 ：Hfr lac+ade+strs F-lae-ade-strr 混合60分，链霉素基本培养基。未杂交的被杀死。选出来的都是ade+strr。因为ade+是在lac+之后进入F，所以，lac自然进入，形成了部分二倍体。在ade后部发生了交换，但另一交换位置需进一步鉴别。 将重组子菌落影印培养在EMB（曙红+美蓝）培养基上，如果是紫红色，说明重组子含有lac+ade+，另一交换发生在lac前端，如果粉红色，说明交换发 生在lac和ade之间，为lac-ade+重组子。lac+ade不会产生。 用时间单位法lac-ade的图距是一分钟，所以时间单位和重组值的关系大致是1分钟 = 20%和重组值 第五节 F因子与性导 一、F、 F 和Hfr 品系的关系二、F因子带有插入细菌基因的环状F因子是一个复制子，称为F因子。 三、性导利用F因子形成部分二倍体叫做性导 sexduction， Fduction 四、F，Hfr，F的接合比较第六节 转化与转导作图 一、细菌的转化与作图 1概念：转化是指游离的细菌DNA片断被吸收到不同的细菌细胞内，并整合于受体的基因组中。 转化时供体DNA片段平均长度约为20000个核苷酸对，DNA片段进入受体后和受体染色体形成部分二倍体，因此有可能发生重组，从而使受体细胞发生稳定的遗传转化。 2转化过程 具体过程包括几个连续的阶段： (1)双链DMA分子和细胞表面受体部位进行可逆性结合。 (2)供体DNA片断被吸入受体细胞，并要防止受体DNA酶的破坏。 (3)供体DNA进入受体后，立即从双链DNA转变成单链DNA，其中一条单链被降解。 (4)未被降解的一条单链DNA部分地或整个地插入受体细胞的DNA链中，形成杂合的DNA分子。 (5)这种杂合DNA复制，分离以后，形成一个受体亲代类型的DNA和一个供体与受体DNA结合的杂种双链DNA。从而导致基因重组，形成各种类型的转化子（transformant）。图示：转化中单链外基因组片与双链内基因驵间整合过程。 (6)供体单链与受体DNA之间结合形成一段异源双链区。转化过程的最后结果取决于误配核苷酸对的修复校正。如切除供体单链，则无重组发生。如切除受体单链则产生重组体，如果无校正作用发生，则该细菌经DNA复制和细胞的分裂产生一个有受体基因型的细胞，一个具有重组体基因型的细胞。 3转化条件从一个供体菌株分离出来的DNA与另一受体菌株活细胞接触，大约只有1%的受体细菌细胞可吸收外源DNA，并发生遗传性的转化。转化频率低的原因可能是： (1)只是在特定区域形成临时性通道受体部位。数目有限。 (2)还必须有酶，或蛋白质分子以及能量等的协同作用。能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞称为感受态细胞；而促进转化作用的酶或蛋白质分子称为感受态因子。 4转化作图 （1）连锁关系的确定 观察DNA浓度降低时的转化频率的改变。因为在较低的浓度范围内，转化频率和转化DNA的浓度成正比关系。 如果A和B是连锁的，那么当DNA浓度下降时，AB同时转化频率下降和A或B转化频率下降程度相同；如果A和B并不连锁，那么AB转化频率下降将远远超过A或B转化频率下降的程度。 （2）Nester等用枯草杆菌的一个菌株作为供体trp2+， his2+,try1+，提取其 DNA向受体trp2,his2,try1，菌株进行转化，结果如表65。（trp色氨酸，tyr酪氨酸，his组氨酸）二、转导与作图 转导是指通过噬菌体把细菌的基因从一个细菌转移到另一个细菌的过程。 (一)普遍性转导（general transduction） 1、Lederberg 和 N. Zinder的杂交试验 为了验证沙门氏菌是否也存在类似于大肠杆 菌中的接合现象， LT22 phe-trp-tyr-his+ LT2 phe+trp+tyr+his- phe苯丙氨酸 trp色氨酸 tyr酪氨酸 his组氨酸结果10-5频率出现野生型菌株。（基本培养基）U型管试验：也能发生野生型。推测：存在可滤性因子FA（filterable agent） 进一步实验证明可滤性因子FA与温和型噬菌体P22相似： (1)过滤因子FA与P22大小、质量相同； (2)FA可被P22抗血清灭活； (3)用LT2抗P22品系代替敏感的LT2，则不能发生重组。2、普遍性转导的过程LT22 LT2实验的解释 ： T22是携带了P22原噬菌体的溶源性细菌。LT2是对P22敏感的非溶源性细菌 ：3、普遍性转导作图 P22噬菌体携带供体任何染色体片断完全是随机的。即转导各个标记基因的频率大致相等，这种转导称为普遍性转导。 能装入噬菌体头部的DNA充其量约为一噬菌体基因组的大小，即沙门氏菌的2030个基因，相当于沙门氏菌的1%，而在制备物中又只有0.3%左右的噬菌体是该装宿主DNA，因此任一基因的转导频率约为0.3%1%=310-5。 如果细菌的两个基因之间距离大于噬菌体的染色体长度，一般不能同时进行转导，除非携带不同基因颗粒同时感染同一细菌细胞，而这种频率仅为10-510-5。所以如果两个基因始终是一起转导或同时转导频率较高，那么就足以证明这两个基因是连锁的。两个基因同时转导的现象和为共转导或称并发转导（contransduction）。两基因共转导频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密。相反，共转导频率愈低，则表明这两个基因距离愈远。 例1 用大肠杆菌P1噬菌体进行下列转导实验 供体thr+ leu+ azi+受体thr- leu- azi- 例2 大肠杆菌供体trpA+supC+pyrF+受体trpA-supC-pyrF- 实验结果： trpA 色氨酸（tryptophan） supC 赭石突变抑制基因 pyrF 嘧啶生物合成基因 并发转导率 supC+trp