高度水解芝麻肽最适酶类的选择与水解条件的确定.doc

高度水解芝麻肽最适酶类的选择与水解条件的确定摘要：以芝麻蛋白为底物，用改进的pH-stat法比较四种蛋白酶对芝麻蛋白质的水解能力，并从中选出两个对芝麻蛋白具有较强水解能力且价格相对便宜的酶：Alcalase和AS1.398。通过正交试验确定了二者的最适反应条件，Alcalase最适条件为：温度55，pH值为8.5，底物/酶量比为80（g/g），4h后水解度可达19.36%。AS1.398酶的最佳条件：温度40，pH值为7.0，0.001%CaCl2添加量为2ml,底物/酶量比为40（g/g），4h后水解度可达23.64%。关键词：芝麻蛋白酶解水解度1前言近十年来，国内外对生物活性肽进行了大量的基础和应用研究，国外已有多肽药物和营养产品推向市场，市场前景极为可观1。研究表明：活性肽都以非活性状态存在于蛋白质长链中，当采用适当的方法水解得到这些低肽时，其活性就释放出来。许多活性肽具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的功能，它们与机体各种功能调节、疾病的发生及免疫、内分泌、衰老、代谢等有着非常密切的关系，在生命活动中起着非常重要的作用2。芝麻中的蛋白质含量为20%22%，其榨油后副产品麻渣或饼粕含蛋白质38%50%，含量丰富，且蛋白质氨基酸除赖氨酸含量低外，其余与牛肉或酪氨酸相比，接近或达到FAO/WHO建议优质蛋白，其富含含硫氨基酸，尤其蛋氨酸含量高于其它植物蛋白。但是已研究证实蛋白质在人体内并不是全部以单个氨基酸形式被吸收，而是以小肽、寡肽在人体内吸收且这种小肽、寡肽吸收要比氨基酸好，都具有生物活性功能3。因此要在工业上生产具有生理活性的肽段就要求我们对酶进行筛选时要尽可能选用速度快，水解能力强的酶类。另外考虑到经济因素，还要求酶的价格要相对便宜，本文的目的就是选出水解反应所需要的酶类，并通过正交试验确定其最适作用条件。2材料与方法2.1试验材料芝麻(凤阳县芝麻厂)；胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司），上海；木瓜蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司），上海；Alcalase酶（无锡酶制剂厂），无锡；AS1.398中性蛋白酶（无锡酶制剂厂），无锡；其它化学试剂均为分析纯。2.2试验方法2.2.1芝麻蛋白的制备4采用碱溶法提取。称取芝麻500g，粉碎，过筛，加水（料液比为115），搅拌均匀。加入一定量的0.05%NaOH溶液调节溶液的pH值至10.0，控制温度在50，缓慢搅拌，使蛋白质在碱性状态下溶解，一般溶解时间为4h，离心分离，得到蛋白液。取上述蛋白液调节pH值至芝麻蛋白的等电点（pH值在4.5左右），静置，沉淀，干燥得到芝麻分离蛋白。粗蛋白含量为89.7%。2.2.2酶活力的测定5,6采用改进的福林酚法。各个酶在推荐的最适条件下（见表1），以酪蛋白为底物进行测定。酪蛋白活力单位定义为在特定的试验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1g氨基酸的酶量为一个活力单位。2.2.3芝麻蛋白溶液的配制及预热处理7将芝麻蛋白溶于水，配成8%的溶液，并调整其pH至7.0，然后在90预热30min。2.2.4芝麻蛋白质的水解8将经过预热处理的芝麻蛋白溶液的pH（用2mol/LNaOH或HCl调节）和温度调至酶作用的最适条件（如表1）。加入蛋白酶进行水解，待反应结束后在100水浴中灭酶10min。2.2.5酶解蛋白质水解度的测定在中性和碱性条件下采用改进的pH-stat法，在酸性条件下采用TNBS法9,10。表1四种酶推荐的最适温度和pH值（插图一）Table1ThesuggestedoptimumtemperatureandpHoffourkindsofenzyme表2四种蛋白酶的酶活力及其价格（插图二）Table2Theenzymeactivityandpriceoffourkindsofflavourzyme3结果与讨论3.1四种蛋白酶对芝麻蛋白的水解程度的比较为了筛选出适宜于制备高度水解芝麻短肽的蛋白酶，本试验首先研究了在相同的酶活力单位与底物浓度比的条件下，四种蛋白酶对芝麻蛋白的水解能力进行比较，结果见图1。图1四种蛋白酶对芝麻分离蛋白的水解能力（插图三）Figure1Thehydrolysisabilitytosesameproteinoffourkindsofflavourzyme由图1可见，在所试用的四种蛋白酶中AS1.398酶单位价格的酶活力最高，水解能力最强，而且价格相对也比较便宜。然而Alcalase酶的价格是最便宜的，因此也被选用为试验的酶制剂。3.2Alcalase酶水解芝麻蛋白质最佳条件的确定3.2.1Alcalase酶的添加量和酶解时间对水解度的影响在Alcalase酶推荐的温度和pH值下，保持底物浓度、底物总量（8%）不变，改变酶的使用量，即Alcalase酶的添加量依次为0.5、1.0、1.5和2.0g，对芝麻蛋白进行水解，并选择在不同的时间段测定水解度，结果如下。图2Alcalase酶的添加量对水解度的影响（插图四）Figure2TheeffectofaddquantityofAlcalaseonhydrolysisdegree从图2中可以看出，随着酶量的增加和时间的延长，水解度是逐渐上升的。综合考虑经济等原因选用酶的最佳添加量为80g底物蛋白中加入1g的酶，即底物/酶量比为80:1，水解时间为4h。3.2.2Alcalase酶解试验影响酶解的主要因素有pH值、温度、酶解的时间及酶的添加量。在前面已经确定了酶的添加量和酶解时间的基础上，本试验又通过23析因试验确定最佳pH值和酶解的温度。结果表Alcalase酶水解芝麻蛋白的最佳条件为：温度为55，pH值为8.5，底物/酶量比为80（g/g），4h后水解度可达19.36%。3.3AS1.398酶水解芝麻蛋白最佳条件的确定3.3.1AS1.398酶的添加量和酶解时间对水解度的影响在AS1.398酶推荐的温度、pH值和激活剂条件下，底物浓度总量（80g）不变，改变酶的添加量，分别加入酶0.5、1.0、1.5和2.0g，做出酶反应曲线如图3所示。由图3可以看到，芝麻蛋白的水解度随着酶量的增大而增大，在添加量为2g时，酶的水解度有一个显著的升高，而低于此值（如1g到1.5g）时则不够明显。从制取高水解度肽段考虑，决定取酶的最佳添加量为每80g底物添加2g酶，即底物/酶量比为40：1（g/g）。而且由上图可知，最适宜的水解反应时间为4h。图3AS1.398酶水解度与酶的添加量的关系（插图五）Figure3TherelationbetweenhydrolysisdegreeandaddquantityofAS1.3983.3.2AS1.398酶解正交试验AS1.398酶是中性蛋白酶,它可以以钙、镁离子激活12，因此本试验在考察酶的最适温度和pH值的同时，考察Ca2+添加量对水解进程的影响，正交试验结果见表3。试验时采用的底物浓度为8%，总量为80g，底物/酶量比为40（g/g）。表3L9（33）正交试验结果（插图六）Table6L9(33)orihogonaltest由正交表的极差分析可知，在其取值范围内A即pH值是主要的影响因素，而B和C是次要因素，最佳因素组合为A1B1C3。因此从节省能源的角度考虑，取水解温度为40，C因素在2ml添加时水解度取得最大值，可见Ca2+对AS1.398有一定的激活作用。由于pH值是主要的影响因子，且得出的最佳pH值是在中性条件下，因此本试验又测定了接近中性条件下的酸性环境水解度是否会更大，所以在选定的温度和激活剂的情况下，试验又测定了pH值为6.5和6.8的酶水解进程。结果表明，水解4h的水解度分别为11.84%和17.35%。可以确定在pH值为7.0水解4h时的水解度取得了最大值，从而确定最佳pH值为7.0。由上述可知AS1.398酶水解芝麻蛋白的最佳条件为：温度为40，pH值为7.0，0.001%CaCl2添加量为2ml,底物/酶量比为40（g/g），在此条件下水解4h后的水解度可达23.64%。4结论41本试验选择Alcalase酶和AS1.398酶制备高水解度芝麻肽。42Alcalase酶的最适酶解条件为：温度为55，pH值为8.5，底物/酶量比为80（g/g）。在此条件下水解4h后，水解度可达19.36%。43S1.398酶的最适酶解条件为：温度为40，pH值为7.0，0.001%CaCl2添加量为2ml,底物/酶量比为40（g/g），在此条件下水解4h后的水解度可达23.64%。以上条件的确定为进一步水解制备高水解度和功能性的芝麻肽奠定了基础。5讨论51在试验中木瓜蛋白酶4h后单位酶活对芝麻蛋白质的水解度虽与Alcalas