第三章 固定化酶与固定化细胞.docx

n 第三章 固定化酶与固定化细胞n 第一节 概述 n 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 n 第三节 固定化酶的制备 n 第四节 固定化细胞 n 第五节 固定化辅酶和原生质体 n 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 n 第一节 概述n 什么是固定化酶？n 第一节 概述二 固定化酶的优缺点n 多次使用 n 可以装塔连续反应n 优点： 纯化简单n 提高产物质量n 应用范围广n 缺点： 首次投入成本高n 大分子底物较困难n 第一节结束n 点击返回 n 第二节 固定化酶的性质及其影响因素n 一 影响固定化酶性质的因素n 二 固定化后酶性质的变化n 三 评价固定化酶的指标n 一 影响固定化酶性质的因素 1 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。n 二固定化后酶性质的变化n 1 固定化对酶活性的影响：n 酶活性下降，反应速度下降 2 固定化对酶稳定性的影响n 稳定性提高（原因） n 3 pH的变化（原因） n 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。n 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。n 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离 n 酶的pH值高；反之则低n 固定化后酶稳定性提高的原因：n a. 固定化后酶分子与载体多点连接。n b. 酶活力的释放是缓慢的。n c. 抑制自身降解，提高了酶稳定性。n PH 对酶活性的影响：n （1） 改变酶的空间构象n （2）影响酶的催化基团的解离n （3）影响酶的结合基团的解离n （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。n 4 最适温度变化 一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。5 底物特异性变化n 作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化n 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 n 特异性往往会变化。6 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化 （链接） n 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化由于分配效应：=Si微环境/S宏观环境 Km=Km/(表观米氏常数)n （1） 载体与底物带相同电荷，SiS,Km固定化酶降低了酶的亲和力。n （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，SiS，则1,KmKmn 三 评价固定化酶的指标：n 1酶活定义（IU)：n 在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。计量单位n 2. 酶比活定义（游离）：n 每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位品质的体现n 3. 固定化酶的比活：n 每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。n 4. 操作半衰期：n 连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2） 衡量稳定性的指标。n 5. n 6. n 或称偶联效率，活力保留百分数。n 7.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化n 酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。n n 四 固定化酶的活力测定方法介绍n 1. 振荡测定法：称取一定量的固定化酶 加入一定量的底物溶液， 一边振荡或搅拌，一边进行催化反应 取出一定量的反应液进行酶活力测定。n 2. 酶柱测定法：将一定量的固定化酶装进具有恒温装置的反应柱中 让底物溶液以一定的流速流过酶柱 收集流出的反应液 测定其中产物的生成量或底物的消耗量。n 3. 连续测定法n 利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。n 第二节固定化酶的性质及其影响因素提要n 影响固定化酶性质的因素n 固定化酶的性质n 评价固定化酶的指标 n 第二节结束n 点击返回 n 第三节 固定化酶的制备n 一 一般方法及特点n 二 酶的固定化方法n 一 一般方法及特点1 四大类方法：n 吸附法（包括电吸附法）n 结合法（无机多孔材料）n 交联法（双功能试剂） n 包埋法（微胶囊法） n 各类固定化方法的特点比较: n 2 选择方法依据： n （1） 酶的性质n （2） 载体的性质n （3） 制备方法的选择n 3 固定化后酶的考察项目：n （1） 测定固定化酶的活力，以确定固定化过n 程的活力回收率。n （2） 考察固定化酶稳定性n （ 2） 考察固定化酶最适反应条件n 二 酶的固定化方法n （一） 吸附法n （二） 结合法n （三） 交联法n （四） 包埋法（entrapping method）n 酶和细胞固定化示意图n （一） 吸附法 1 物理吸附： 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。n 2. 常用载体：n （1）无机载体：氧化铝、活性碳、皂土、硅藻土、金属氧化物、硅胶。一般吸附量1mg蛋白/克吸附剂n （2）有机载体：淀粉、白蛋白等。一般吸附量几十毫克蛋白/克吸附剂n 研究热点：大孔型合成树脂、陶瓷n （二）结合法n 1. 离子键结合法n 2. 共价键结合法n 1. 离子键结合法n 概念n 常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶n 使用注意：pH、离子强度、温度n 2 .共价键结合法n （1）概念n （2） 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键n （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体n （4）载体活化的方法n A重氮法n B叠氮法n C烷基化反应法n D硅烷化法n E溴化氰法n A重氮法n 反应示意式如下 n A重氮法n 目前在我们国内用的较多的载体是对氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素、琼脂糖，葡聚糖凝胶和琼脂等n 该方法需要载体具有芳香族氨基n A重氮法n 反应式及原理n A重氮法例n 5-磷酸二酯酶的固定化。此酶用来降解核酸，可分离得到四个5-单核苷酸n （本成果荣获国家发明三等奖，中国科学院上海生化研究所袁中一等，我国第一个用于工业生产的固定化酶） n B 叠氮法n 例n 用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶，步骤如下：n 酯化：CM-纤维素先洗涤干燥，然后悬于无水甲醇中，在冰浴中通入HCl气体，进行酯化反应；然后洗涤，空气干燥。n 肼解。把酯化后的CM-纤维素悬于甲醇中，再加入80%水合肼回流反应1小时，过滤，洗涤干燥。n 叠氮化。肼解后的CM-纤维素（1g）加入150ml 2% HCl在冰浴中混合，搅拌滴加9ml 3% NaNO2反应20min，过滤用冷蒸馏水洗涤，同时加酶 n (4) 偶联。经叠氮化后的载体加入0.05N pH 8.0 磷酸缓冲液（内含250-500mg酶），5搅拌2-3小时，过滤，用 0.001N HCl，水洗涤，即为固定化胰蛋白酶（冻干保存）n C烷基化反应法n D硅烷化法n 一般常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。 n 多孔玻璃特点：n 机械强度好，表面积大。n 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。 n D硅烷化法n D硅烷化法n D硅烷化法n E 溴化氰法n 本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等.n （三）交联法n 概念：n 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。n 用处：n 可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。n （三）交联法的形式n 交联法有2种形式：酶直接交联法n 酶辅助蛋白交联n 双重固定法 （1） 吸附交联法n （2） 交联包埋法n 酶直接交联法n 概念：n 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。n 影响因素：n 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。n 酶辅助蛋白交联n 概念：n 为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质.n （1） 吸附交联法n 概念：n 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。n 用此法所得固定化酶也可称为壳状固定化酶。n （2）交联包埋法n 概念：把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。n 优点：这样避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。n （四） 包埋法（entrapping method） n 定义：n 将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。n （四） 包埋法n 包埋法分为网格型和微囊型n 1网格型n 2微囊型n 1网格型n (1) 概念 ：n 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。n 2微囊型包埋法n 是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。 n 微囊化法制备固定化酶有两种方法n 界面沉淀法n 界面聚合法n 界面沉淀法n 这是一种简单的物理法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。此法条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。n 界面聚合法n 是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。n 界面聚合法n 第三节提要n 一般方法及特点n 酶的固定化方法n 第三节结束n 点击返回 n 第四节 微生物、植物和动物细胞固定化 n 细胞特性比较n 概念：n 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.n 该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。n 细胞固定化方法n 吸附法n 包埋法n 吸附法n 它主要通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。 n 影响吸附法的主要因素 n （1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小n （2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质n （3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料n 包埋固定法 n 包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。n 包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。 n 包埋法分类n 常用载体：琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺n 常用凝胶包埋法n 通过改变载体溶液参数包埋细胞 n 改变载体溶液、操作温度、盐浓度、pH值和溶剂等参数时，亦可使其转变为凝胶状态，将细胞包埋其中。n 研究热点光交联树脂包埋法 n 例：相对分子量为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得n 固定化细胞的目的n 微生物菌体：不需多次培养、扩大，从而缩短了发酵生产周期n 植物细胞n 动物细胞n 第四节固定化细胞提要n 特点n 方法n 目的n 第四节结束n 点击返回 n 第五节 固定化原生质体和辅酶n 一 原生质体固定化的方法n 制备原生质体将原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中配成原生质体悬浮液包埋法固定化原生质体。n 关键：原生质体如何制备？n 二 原生质体的制备n 将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中去细胞壁分离纯化得到原生质体-活性鉴定n 三 酶解注意要点n 1 酶解前要预处理：主要是为了使酶渗透到细胞器中去。n 采取的策略：先加入物质抑制或阻止某种细胞壁的成分合成，可以使酶插入。n 一般加入：巯基乙醇，Triton-100,甘氨酸、青霉素。n 三 酶解注意要点n 2 酶系选择：n 溶菌酶n 蜗牛酶n 葡聚糖酶n 纤维素、半纤维素、和果胶酶n 3 酶浓度选择（0.5%-1%）n 三 酶解注意要点n 4 酶解温度和pHn 5 酶解终点确定n 四 稳定剂（高渗溶液）要求n 1 加入的化合物对细胞和原生质体无毒性n 2 不会影响水解酶的活性n 3 对代谢产物无不良影响n 四 稳定剂加入操作注意点n 1一定pH （酶和菌体活性最高） n 2一定的浓度（过高浓度原生质体易脱水皱缩）n 3种类：无机盐-对细菌n 有机物糖和糖醇-酵母n 4易于渗入质膜、易于被原生质体和菌体分解的物质不宜作为稳定剂n 五 原生质体细胞活性的检测n 1 荧光素双醋酸盐（FDA) 染色法n 2 酚藏花红染色法n 3 伊文思兰染色法n 四 辅酶固定化n 1 原因n 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化反应(递氢、递电子或递某些化学基团的作用）n 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生n 有机辅因子价格昂贵n 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生n 辅酶固定化的方法：n 2 固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。n 3 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。n 策略：先在辅酶的一定部位进行修饰-引入功能团和间隔臂（形成辅酶衍生物）- 再与水溶性高分子结合n 辅酶的固定化n 辅酶的固定化n 辅酶再生的形式：n 第五节 固定化原生质体和辅酶的固定化n 原生质体n 辅酶固定化 n 第五节结束n 点击返回 n 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用 n 酶反应器介绍n 酶反应器的选择和应用n 固定化酶和细胞的应用n 生物催化反应器工程n 一酶反应器。n 分批搅拌反应器。n 搅拌罐型n 连续流搅拌桶反应器。n 固定床型 （填充床反应器）n 流化床反应器n 连续搅拌桶-超滤反应器n 循环反应器n 膜式反应器n 鼓泡塔型 n 分批搅拌反应器n 反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小规模试验n 连续流搅拌桶反应器n 连续搅拌釜式反应器n 填充床反应器n 旋转填充床n 流化床反应器n 与连续流搅拌桶式反应器类似，是让适量的颗粒状酶悬浮于反应床中，不用搅拌器，而是底物向上流过固定酶床，因此流速要适当控制。n 循环反应器n 高效内循环生物反应器（HCR）n 连续搅拌桶-超滤反应器n 膜式反应器n 定义：n 由膜状或板状固定化酶或固定化微生物组装的反应器均称为膜式反应器。n 类型：n 直接接触式酶膜反应器；n 扩散型膜反应器；n 多相酶膜反应器。n 鼓泡塔型反应器n 适用对象：反应中涉及气体的吸收或产生时适用。n 气体进入方式：n 与底物一起从底部进入，经过气体分散板分散。n 和循环液从底部以切线方向进入。n 生物催化反应分离耦合反应器n 反应分离耦合反应器成功实现产物在线分离n 产物在线分离策略实现头孢克罗半连续制备n 减压式反应器用于生物催化反应中易挥发产物的在线去除n 反应器选择n 酶的形式： 溶液酶n 颗粒状或片状固定化酶n 膜状和纤维状固定化酶n 底物的物理性质：溶解性、颗粒物质和胶体物质n 反应操作要求n 酶的稳定性n 应用和可塑性和成本n 酶反应器的应用n 控制酶反应器液态流动方式n 反应器中流动方式的改变会使酶与底物的接触不良，造成反应器生产能力降低。n 流动方式改变造成反混程度的变化，会发生程度不同的反应或副反应。n 物料粒子进入反应器后所经历的时间称为粒子的年龄。粒子离开反应器时的年龄称为停留时间。n 反应器内不同年龄的粒子间的混合称为反混。n 酶反应器的应用n 酶反应器对底物恒定转化n 目的：反应器能平稳的进行工作，有利于实现自控操作n 方法：控制底物流速n 国外热点：将固定化酶反应器串联或并联操作。n 酶反应器的应用n 保持酶反应器的稳定性：n 防止酶变性、中毒、自溶或载体磨损。n 防止酶反应器中微生物污染n 向底物中加入杀菌、抑菌物质，或有机溶剂n 底物物料预先除菌n 在45度以上环境中或酸、碱缓冲液中进行反应n 酶反应器每次用后消毒n 二固定化酶（细胞）的应用n 1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n 2 固定化酶在医药治疗上的应用n 3 固定化酶在分析化学中应用n 4 固定化酶和亲和色谱n 5 固定化酶与环境保护n 6 新能源开发中的应用n 7 固定化酶在基础理论研究中应用n 1 固定化酶（细胞）在工农业生产上的应用n 葡萄糖异构酶世界上生产规模最大的一种固定化酶。n 用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。n n 葡萄糖异构酶n 葡萄糖 果糖 果葡糖浆n 固定化酶在工业生产中的应用n 聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸n 利用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶n 固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类n 固定化原生质体的应用n 研究中：n 固定后化枯草杆菌原生质体生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞中的碱性磷酸酶，全部分泌到发酵液中，提高产率36%，可连续使用37天。n 2 固定化酶在医药治疗上的应用n 例1n 固定化青霉素酰化酶，只要改变pH值等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸酸或7-氨基头孢霉烷酸n 也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应n 合成新的具有不同恻链基团的青霉素或头孢霉素n 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素n 青霉素酰化酶催化合成头孢类抗生素n 酶促合成头孢类抗生素n - Reversible reaction n - Hydrolysis of substrate or product by biocatalystn - Difficulty of separation of product from reactantsn 固定化酶在医药治疗上的应用n 例2：制造人工肾n 利用固定化脲酶透析液和活性炭一起制成的体外循环装置，大大提高了疗效。固定化脲酶由酶与离子交换树脂一起制成微小胶囊尿酶可分解尿素为NH3和CO2，NH3被树脂吸附，CO2可由肺部排出，活性炭用以吸附尿素以外的代谢废物。 n 3固定化酶在分析化学中应用n 酶柱和酶管，可与分光光度计、荧光计或电量计结合，形成酶电极，进行某些物质的自动分析。n 酶电极