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生物芯片及其在食品安全检测中的应用B食品092 周长桂 23 摘 要: 生物芯片是一种全新微量分析技术, 被誉为21 世纪生命支撑平台。本文探讨了生物芯片两大理论基础) 分子生物技术和微细加工技术; 综述了包括基因芯片、蛋白芯片和芯片缩微实验室三类生物芯片的研究应用现状; 深入探讨了生物芯片在食品安全检测中的应用前景, 主要表现在食品毒理学、食品卫生检验、分子水平上阐述食品营养机理、转基因食品的检测。 关键词: 生物芯片; 食品; 安全检测 目前, 全球食品安全形势不容乐观, 主要表现为食源性疾病不断上升, 恶性食品污染事件接二连三, 食品加工新技术与新工艺带来不确定性危害。世界范围内由于食品安全卫生质量而引起的食品贸易纠纷不断, 高新技术应用于食品安全检测具有无限的发展空间。 生物芯片是九十年代初发展起来的一种全新的微量分析技术, 综合了分子生物技术、微加工技术、免疫学、计算机等多项技术, 生命科学研究中不连续的分析过程, 集成在芯片上完成, 实现样品检测分析过程的连续化、集成化、微型化和信息化, 生物芯片技术作为一代生物技术, 在食品领域中具有广阔的基础研究价值和产业化前景。1 生物芯片技术简介1.1 生物芯片技术的原理 生物芯片技术是采用原位合成或微量点样等方法, 将大量生物大分子如核酸片段、多肽片段甚至组织切片、细胞等样品有序地固定在硅胶片或聚丙烯酰胺凝胶等支持物的表面, 组成密集二维分子排列, 然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交, 通过特定的仪器如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄像机对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析, 判断样品中靶分子的数量, 从而达到分析检测的目的。1.2 生物芯片制备的基本流程 所有生物芯片制备都包括4 个基本要点: 芯片的构建、样品的制备、生物分子相互反应和结果检测分析。1.2.1 芯片的构建 目前芯片制备主要是采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理片芯( 玻璃片或硅胶片) , 然后使DNA 片段或蛋白质分子按顺序排列在芯片上。因芯片种类较多, 制备的方法也不尽相同, 但基本上可以分成原位合成( in situ synthesis) 与微矩阵点样( microarraydistribute) 两大类。 原位合成是采用光导化学合成和照相平板印刷技术在载体表面合成寡核苷酸探针, 其中原位合成法又可分为光引导原位合成、喷墨打印和分子印迹原位合成3 种。由于短核酸探针阵列具有密度高、速度快、效率高等优点, 原位合成DNA 微点阵适于进行突变检测、多态性分析、杂交测序等需要大量探针和高杂交严谨性实验。 微矩阵点样法是将通过液相化学合成寡核苷酸链探针, 或是PCR 技术扩增得到cDNA 或生物分子, 由阵列复制器(arraying and replicating device, ARD), 或阵列机(arrayer)及电脑控制的点样仪, 准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上, 再由紫外线交联固定后即得到理想的芯片9。该方法在多聚物设计方面与前者相似, 合成工作用传统DNA或多肽固相合成仪完成, 只是合成后用特殊自动化微量点样装置将其以较高密度涂布于芯片载体上。这种方法生产的芯片上探针不受探针分子大小种类的限制, 能够灵活机动地根据使用者的要求制作出符合目的的芯片。1.2.2 样品制备 生物样品是复杂生物分子混合体, 除少数特殊样品外, 一般不能直接与芯片反应, 必须将样品进行生物处理。对于基因芯片, 通常需要逆转录成cDNA 并进行标记后才能进行检测。在PCR 扩增过程中进行样品标记的方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。而通常用来制备蛋白芯片的蛋白质在点样前要采用合适的缓冲液将其溶解, 并要求具有较高的纯度和完好的生物活性。1.2.3 生物分子反应 生物分子反应是芯片检测的关键一步, 样品DNA与探针DNA 互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如果是基因表达检测, 反应时需要高盐浓度、低温和长时间(往往要求过夜)。如果要检测是否有突变, 因涉及单个碱基的错配,故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高特异性杂交。检测蛋白结构的免疫芯片须保证抗原、抗体的特异性结合。芯片分子杂交的特点是探针固化, 样品荧光标记, 一次可以对大量生物样品进行检测分析。1.2.4 反应图谱的检测和分析 生物芯片在与荧光标记的目标DNA 或RNA 杂交后或与荧光标记的目标抗原或抗体结合后, 用激光共聚焦扫描芯片和CCD 芯片扫描仪可将芯片测定结果转变成可供分析处理的图像和数据。获得图像数据后,进行数据分析有3 个基本步骤: 数据标准化, 数据筛选, 模式鉴定。无论是成对样本还是一组实验, 为了比较数值, 对数据要进行某种必要的标准化。第二步, 进行数据筛选, 去掉没有信息的基因。第三步, 鉴定数据的模式和分组, 给以生物学的解释。数据处理和破译的方法也是不同的。生物芯片需要一个专门系统处理芯片数据, 一个完整芯片数据处理系统应包括芯片图像分析和数据提取及芯片数据统计学分析和生物学分析; 另外还要做芯片数据库管理、芯片表达基因互联网检索等。目前, 质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏、快速, 有取代荧光法的趋势。2生物芯片技术在食品检测中的应用 生物芯片将会成为食品卫生监督和商品检验检疫中的重要工具。采用生物芯片技术, 可以最快速、最大量、最高效地对病原体、转基因产品以及中药质地( 农药、重金属含量, 产地真伪等) 进行检测。根据检验内容和对象的不同, 检验检疫基因芯片可分成4 种: 食品卫生检验芯片( 病原体、激素、农药残留、真伪) 、植物检疫芯片、动物检疫芯片、转基因作物检疫芯片。2.1 在转基因食品检测中的应用 自1994 年第一个转基因产品上市以来, 随着基因工程的发展, 转基因食品越来越多地进入消费市场。到2005 年底, 全球转基因作物达100 多种, 由转基因作物生产、加工的转基因食品和食品成分达4 000 多种。转基因食品在带来巨大利益的同时,其安全性也越来越受关注。对转基因作物或转基因食品的检测和鉴定不仅成为满足公众知情权的必要技术, 而且也是相关法规的必然要求。不断发展和完善的基因芯片技术可对转基因食品进行定性检测, 还可以定量的检测其种类。该技术将大量的探针分子固定在支持物上, 与标记的样品分子杂交, 通过检测每个探针分子杂交信号的强度, 对结果进行数据分析, 可以获取样品分子的序列和数量信息, 判断该样品是否含有转基因的成分, 是否在安全限度内。利用该技术可检测食用成品和鲜活的动植物材料。灵敏性、自动化程度高, 特异性强,假阳性低, 简便快速, 是一门极有发展前途的技术。2. 2 在食品毒理学研究中的应用 传统的食品毒理学研究必须通过动物实验模式来进行模糊评判, 它们在研究毒物的整体毒性效应和毒物代谢方面具有不可替代的作用。但是, 这不仅需要消耗大量的动物, 而且往往费时费力。另外,所用的动物模型由于种属差异, 得出的结果往往并不适宜外推至人, 而且动物实验中所给予的毒物剂量远远大于人的暴露水平, 并不能反映真实的暴露情况。所以, 传统的动物实验仅仅是一种粗糙的、不精确的方法。Agshari 等( 1999) 报道生物芯片技术的应用将在毒理学领域带来一场革命。生物芯片可以同时对几千个基因的表达进行分析, 为研究新型食品资源对人体免疫系统影响机理提供完整的技术资料。并通过对单个或多个混合体有害成分进行分析, 确定该化学物质在低剂量条件下的毒性, 并且分析推断出该物质的最低限量。最近, 美国环境卫生科学研究所( NIEHS, NationalInstitute of Environment Health Sciences) 的科学家小组开发了一种革命性的工具) 毒理芯片(Toxchip) 。虽然Toxchip 不能完全取代动物实验, 但它可以提供有价值的信息以免做许多不必要的生物试验, 大大降低动物消耗、经费和时间; 由于基因表达对低剂量也很敏感, 所以, Toxchip 用于生物学试验时, 可在近似于人暴露的低剂量水平进行研究, 这样就可以避免实验结果由动物外推至人时所产生的误差, 更真实地反映暴露水平下人体对化学物的反应; 另外, 微阵列芯片可以在基因水平帮助探索急性和慢性中毒之间的联系, 通过观察暴露时间和毒性所致的基因表达谱改变之间关系, 可以由急性中毒性监测慢性毒性效应, 这意味着会缩短生物试验时间, 并使试验剂量更接近于现实和节省相当可观的费用。2.3在食品微生物检测中的应用 食品卫生检测中一个重要的方面是及时准确地检测出食品中的病原性微生物, 这些致病微生物的存在会严重威胁人类的健康。不洁或者带有致病菌的食品不仅会造成巨大的经济损失,还会严重危害消费者的健康, 而食品在生产、加工、运输、销售、消费的各个环节都极易被各种病菌污染。基因芯片技术在微生物研究领域的成功经验为其用于食品微生物特别是致病菌的检测奠定了基础。将常见致病微生物的特异基因序列制成相应的基因芯片, 根据碱基互补配对原理与待测样品进行杂交, 经过检测即可判断待测样品中相应致病微生物的含量。许多研究者对利用基因芯片分析检测食品中常见致病菌进行了一系列探讨。Borucki 等构建的混合基因组微阵列可准确鉴别各种近缘单核细胞增生利斯特菌分离物; Volokhov等通过单管复合体扩增和基因芯片技术检测和鉴别了6 种利斯特菌; Call 等通过分析大肠杆菌O157H7 的志贺样毒素、及溶血素A, 发现基因芯片可准确检测各种O157H7 分离物;Chandler 等确定免疫磁珠分离结合微阵列可检测生禽肉清洗液中的O157H7, 其检测限达103 cfu /mL; 空肠弯曲菌是食源性腹泻的主要病因, 但其主要生物学特征尚不甚明了, Dorrell 等。2.4 中草药筛选及药理研究 我国资源辽阔，中医历史悠久，以中草药神奇的功效而闻名于海内外，但是一直以来中草药功效成分和药效机理成了不解之谜。使得中草药功效成分难以鉴定，极大地限制了我国中草药的出口。多年的药理基因组学研究和临床证实，疾病发生与治疗是环境因素和多重基因产物之间作用的结果，为总结出这些复杂的内在关系，科学家正在研究与疾病关系密切的基因的表达方式即靶基因。在中草药筛选和药理研究过程中，选择合适的靶基因是关键因素。利用生物芯片可迅速比较正常组织及病变组织中相关基因表达的变化，迅速确定靶基因，同时对上千种中药真伪和有效成分进行快速鉴定，确定药物分子的有效性毒性和最佳剂量，从而为中草药筛选和药理研究另辟蹊径。2.5 在食品原料检测中的应用 基因芯片还可以用来筛选发生基因突变的食品原料作物;寻找高产、抗虫、抗病、经济价值高的作物; 进行农药的筛选; 检测各种作物的基因组; 通过比较差异表达寻找新基因, 检测基因表达水平; 进行后基因组学的研究; 进行食品原料作物疾病的检测和检疫。利用基因芯片本身的优点, 可以更详细地了解作物的各个基因的功能, 各种因素如干旱、肥力、光质、光量、植物激素、除草剂等对作物的影响, 从而通过各种处理使得作物向着期望的方向发展, 大大加快食品原料作物新品种的培育。随着基因组测序工作的进展, 许多植物病害的病原微生物基因组被解码, 其表达序列标签( EST) 得到公布, 利用这些EST 序列制成植物检疫芯片, 可用于植物病害的快速诊断, 于发病前进行有效防治, 指导跨区引种、调种、植物检验。目前美国的GeneTrak 公司已开发出多种检测系统, 对转基因食品原料进行检测, 建立转基因农产品的国际贸易技术壁垒。2.6 食品卫生检验 经济全球化的发展, 食品卫生检验与动植物检疫技术已成为WTO 贸易技术壁垒( T BT ) 。世界各国无不加大对食品安全的研究, 尤其是食品卫生检验技术的完善。食品的安全性问题已制约了我国农产品的出口创汇能力以及加入WT O 后的国际竞争力。生物芯片技术是检验、检疫中最快速、大通量、最适用的高新技术。针对检验的内容和对象的不同, 检验基因芯片可分为3 种: 食品卫生检验芯片; 植物检验芯片; 动物检验芯片。针对目前存在的对食品安全情况不明、本底不清的状态, 建立健全食品安全检验检疫监测体系, 对食品安全状态有一个快速的、科学的、量化的了解, 找出食源性疾病的阈值: 建立进出口食品监督管理的预警和快速反应系统。生物芯片在以下几个方面表现出良好的应用前景: ( 1) 食品中毒事件的调查; ( 2) 食品污染生物毒素的检测; ( 3) 食品中污染病原菌的检测; ( 4) 食品中残留农药和抗生素的分析, 总之,随着研究的深入, 生物芯片技术必将在食品安全保障中发挥越来越重要的作用。2.7 在食品营养成分检测中的应用 营养成分与细胞作用后将引起细胞外部形态及内部正常代谢过程的一系列变化。其内部生理活性变化表现在基因表达的变化, 通过检测分析营养物质对细胞基因表达的影响, 就可以推测营养成分的作用机制。通过观察细胞在营养成分作用前后的变化, 可以评价其活性和毒性, 进而确认此物质的作用靶位点。利用基因芯片技术研究食品的营养成分、营养素与蛋白和基因表达的关系, 将为揭示肥胖的发生机理和预防打下基础。此外,营养与肿瘤相关基因表达的研究, 如癌基因、抑癌基因的表达与突变, 营养与心血管疾病、免疫系统疾病等的关系, 都可以采用芯片技术; 还可以利用其研究金属硫蛋白基因与金属硫蛋白、锌转运体基因与微量元素锌的吸收、转运与分布的关系, 视黄醇受体/视黄醇受体基因与维生素A 的吸收、转运与代谢的关系等;还可以检测食品中有毒、有害化学物质、生物毒素等, 以便及时采取有效措施避免各种因食品卫生不良导致的损失。3 结束语 基因芯片技术这种高效敏感检测基因表达为方法的问世, 是生命科学研究方法上的革命, 它能较系统地分析真核细胞的基因表达, 随着新基因的不断克隆和人类基因组计划的完成, 可以认为基因芯片技术一定也会像计算机芯片那样不断扩大容量,升级换代, 基因芯片技术的出现带动了蛋白质芯片类似技术的产生, 以全新思维方式研究生命科学的时代已经到来。在食品科学研究领域有广泛的发展空间和应用前景, 将为人类的营养健康做出无可估计的贡献。参考文献：1 王凤英,等. 生物芯片的研究进展J. 青岛科技大学学报,2003, 9:1415.2 贺猛,等.生物芯片的作用原理及其临床应用J. 西北民族学院学报,2003, 3: 6567.3 陈庆山,等. 生物芯片工作原理及研究进展J. 生物技术,2003, 12:6163.4 杜金伟. 生物芯片及其应用进展J. 肿瘤防治研究,2004, 6: