尖孢镰刀菌寄主专化型电子舌鉴别模型的建立.doc

19尖孢镰刀菌寄主专化型电子舌性脂肪酸判别鉴别模型的建立 收稿日期： 接受日期：基金项目：国家高技术研究与发展计划（863）项目（2006AA10A211）；福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(STIF-Y03)；福建省发改委重点项目（闽发改投资2006781号）。福建省自然科学基金：非致病性尖孢镰刀菌对西瓜枯萎病的免疫抗病机制研究（2008J0055）作者简介：蓝江林（1972-），博士，副研究员，研究方向：生物技术与生物防治。电子邮件：。电话通讯作者：刘波，博士，研究员。研究方向：生物技术与生物防治。电子邮件：。电话刘波*，肖荣凤，朱育菁，胡桂萍（福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003）摘要：应用基于通过微生物细胞脂肪酸成分鉴定的全自动微生物鉴定系统(Sherlock MIS)，检测分析不同寄主尖孢镰刀菌中脂肪酸的生物标记结构组成和的分布特性。，从供试的22个菌株中检测到8种脂肪酸，其中常见脂肪酸有6条，含量60%以上的主要脂肪酸脂肪酸有16:0、18:0 和18:2 CIS 9,12/18:0a 在所有的菌株中都存在，各菌株中3种脂肪酸之和占总脂肪酸含量的60%以上，为主要脂肪酸。对常见脂肪酸进行通过系统聚类分析，可将26个菌株分为3类。各类群的划分结果显示仅与脂肪酸生物标记在各菌株中的存在情况相关，而常见脂肪酸与菌株的来源、和生化型、致病型进化演变等无有对应关系。对常见脂肪酸进行主成分分析得到尖孢镰刀菌脂肪酸中的特征脂肪酸有5个，分别为14:0（X1），16:0(X2)，16:1 CIS 9 (W 7)(X3)，18:0(X4)和18:2 CIS 9,12/18:0a(X5)。对尖孢镰刀菌特征脂肪酸进行Bayes逐步判别分析得到尖孢镰刀菌寄主判别模型为Y1=-183.06+12.24X1+ 8.05X2+5.39X4+3.58X5，Y2=-174.09+10.40X1+7.96X2+5.40X4+3.42X5，Y3=-173.97+14.85X1+7.25X2+6.58X4+3.53X5，当1Yi2时，菌株的寄主为西瓜； 当2Yi3时,菌株的寄主为香蕉；当 Yi3时，菌株的寄主为花生，且模型判对的概率为0.90909，说明脂肪酸14:0， 16:0， 18:0， 18:2 CIS 9,12/18:0a是判别尖孢镰刀菌寄主的四个重要指标，同时该模型比较符合实际，有很好的应用价值。关键词：尖孢镰刀菌；脂肪酸；寄主；判别模型Abstract:Characteristics of PLFA biomarkers in Fusarium oxysporum Schl. were study by means of microbe identification system (MIDI system from USA), The results showed that 8 fat acids were identified in 26 strains,there were fat acids 16:00、18:00 and 18:2 CIS 9,12/18:0a in all strains. Using the cluster analysis method the 26 strains were classified into 4 groups based on the PLFAs biomarkers,and had no association with origin, biochemical variant and pathotype of Fusarium oxysporum Schl.Key: Fusarium oxysporum Schl.；fat acid ；host ; the discriminant model 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）引起的农作枯萎病是一种世界性分布的土传真菌病害，寄主范围广泛，可引起100多种植物发病，造成严重减产，甚至绝收。尖孢镰刀菌由致病菌株与无致病菌株组成，种内的致病菌株具有高度的寄主专化性，根据对不同寄主植物的专化性可分为专化型，在同一尖孢镰刀菌不同的的专化型，引起的发病程度完全不同，如尖孢镰刀菌西瓜专化型就不会侵染黄瓜专化型，同样，尖孢镰刀菌古巴专化型只会侵染香蕉而不会侵染花生作物下面。，根据致病力的差异又划分为许多生理小种。尖孢镰刀菌专化型致病型的监测是研究病原菌群体结构的一项重要措施，为病害的防治提供可靠的病原菌信息，并可为抗病育种提供抗性基因。植物病理学家和育种学家认识到病原真菌的变异对寄主植物抗性的有效性和持久性非常重要，病原真菌的基因型与特定的寄主植物基因型相互作用可导致抗病性在很短时间内丧失【BROWN J K，1996】。然而，鉴定尖孢镰刀菌的专化型，方法复杂、时间很长、实验难度较大。电子舌技术是一种由气相色谱仪和判别模型组成的脂肪酸物质差异分析机构，能识别单一的或混合的脂肪酸溶液。不同的尖孢镰刀菌专化型其脂肪酸种类和组成存在着差异，为电子舌技术作为尖孢镰刀菌专化型识别的工具提供了条件。作者提出利用电子舌技术，“舔”出由气相色谱分析的尖孢镰刀菌脂肪酸组成差异，建立判别模型，鉴别尖孢镰刀菌的专化型。电子舌技术是一种由气相色谱仪和判别模型组成的脂肪酸物质差异分析机构，能识别单一的或混合的脂肪酸溶液。不同的尖孢镰刀菌专化型其脂肪酸种类和组成存在着差异，为电子舌技术作为尖孢镰刀菌专化型识别的工具提供了条件。尖孢镰刀菌微生物细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分，并与微生物DNA具有高度同源性，各种尖孢镰刀菌微生物专化型具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱【杜宗敏，2003】，因此，脂肪酸脂类早在60年代脂肪酸就开始作为标志物用于细菌尖孢镰刀菌鉴定了【刘志辉，2005】。同时微生物脂肪酸中含多种有对植物病原菌拮抗作用的抗菌脂肪酸(Choudhury et al., 1994; Benyagoub et al., 1996; Cantrell et al., 2008)。抗菌活性脂肪酸尤其对真菌性病原菌如链格孢属（Alternaria solani）刺盘孢属（Colletotrichum lagenarium） 镰刀菌属（Fusarium oxysporum f. sp）,镰刀菌属（ Fusarium oxysporum f. sp lycopersici）有抑制作用，对病原菌菌丝体生长和孢子萌发都有很强的抑制作用(Liu et al., 2008)。尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的脂肪酸主要是包括C8到C24(Joshi and Mathur, 1987)。，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的脂肪酸组成其中最主要的成分为18:1 9 c, 16: 0和18:0，.占总脂肪酸的47%，其他的脂肪酸含量低，主要为-羟基，支链，二不饱和和奇数脂肪酸(Ellis et al., 2002)。镰刀菌（Fusarium oxysporum 和 Fusarium roseum）的菌丝体和孢子的脂肪酸包括了主要脂肪酸18:1, 18:2, 和 16:0和微量脂肪酸18:0, 18:3, 和 14:0(Rambo and Bean, 1969)。尖孢镰刀菌专化型脂肪酸的组成和含量不仅与菌株的生长温度有关(Barran and Miller, 1976)。尖孢镰刀菌专化型，其脂肪酸的组成结构还取决于菌株培养条件的C和N组成(Joshi and Mathur, 1987)。Joshi and Dhar, 1987尖孢镰刀菌专化型脂肪酸合成一种从Fusarium oxysporum f. sp. lini分离到的脂肪酶对棉籽油中脂肪酸，坚果油中脂肪酸和尖孢镰孢菌分泌的饱和脂肪酸具有水解作用，显示对尖孢镰孢菌专化型分泌的饱和脂肪酸具有优先特异性(Joshi and Dhar, 1987)，形成了对寄主特异性选择(Joshi and Dhar, 1987)。这一原理，为利用电子舌技术分析尖孢镰刀菌专化型提供了基础。目前，目前脂肪酸生物标记分析较少应用于农业病原真菌的研究，对于尖孢镰刀菌专化型的镰刀菌脂肪酸组成差异研究多集中外界环境如温度，培养基，PHpH值等的影响，而对于由于镰刀菌自身差异，如专化型寄主来源不同引起差异的研究较少。到目前为止，未见关于利用电子舌技术识别尖孢镰刀菌专化型脂肪酸差异的研究的报道。目前利用判别分析法，根据不同寄主镰刀菌的脂肪酸结构特点建立镰刀菌寄主的专化型脂肪酸判别模型的报道还未见。本研究旨在对本研究室从不同寄主分离获得的尖孢镰刀菌，进行脂肪酸气相色谱典型的模式图谱及菌株脂肪酸峰值变化规律分析，为建立电子舌技术尖孢镰刀菌专化型脂肪酸判别模型提供依据，为仪器化鉴别尖孢镰刀菌专化型菌株的脂肪酸种类组群是否与专化型、生理小种、营养亲和群等生理指标具有相关性奠定基础，并建立尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸判别模型，为尖孢镰刀菌寄主专化型的判定提供新的思路和方法。1材料与方法1.1材料供试菌株，不同来源分离纯化的尖孢镰刀菌22株，见表1。 SDB培养基：30 g Sabouraud Dextrose Broth（SDB）+蒸馏水1000 mL。（SDB购于Fisher公司）。皂化试剂：氢氧化钠45 g+甲醇150 mL+水150 mL。甲基化试剂：6N盐酸325 mL+甲醇275 mL。萃取试剂：正已烷200 mL+甲基叔丁基乙醚200 mL。洗涤试剂：氢氧化钠10.8 g+水900 mL。表1 供试尖孢镰刀菌菌株寄主菌株编号采集地点专化型致病型1. 西瓜134永泰西瓜专化型致病2. 西瓜136永泰西瓜专化型致病3. 西瓜137永泰西瓜专化型致病4. 西瓜138永泰西瓜专化型致病5. 西瓜140永泰西瓜专化型致病6. 西瓜141永泰西瓜专化型致病7. 香蕉378漳州古巴专化型致病8. 香蕉384漳州古巴专化型致病9. 香蕉386漳州古巴专化型致病10. 香蕉387漳州古巴专化型致病11. 香蕉389漳州古巴专化型致病12. 香蕉391漳州古巴专化型致病13. 香蕉392漳州古巴专化型致病14. 花生816泉州 致病15. 花生833惠安致病16. 花生834惠安致病17. 花生836惠安致病18. 花生841惠安？致病19. 花生846惠安致病20. 花生847惠安致病21. 花生855惠安致病22. 花生866惠安致病1.2方法（1）尖孢镰刀菌脂肪酸的提取和气相色谱分析脂肪酸提取所用的试剂：包括脂肪酸甲酯混合物标样（由美国MIDI公司提供）、菌落收集培养基（TSBA培养基）、脂肪酸提取所需试剂皂化试剂、甲基化试剂、萃取试剂和洗涤试剂（美国Fisher公司提供），除脂肪酸甲酯混合物标样为直接应用外，其它试剂配制由MIDI公司提供；脂肪酸的提取包括菌落收集、细菌脂肪酸皂化释放、脂肪酸的甲基化、脂肪酸甲酯萃取和基本洗涤等步骤，具体操作由MIDI公司提供。在色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本，色谱条件如下：二阶程序升高柱温，170起始，5/min升至260 ，而后40/min升温至310 ，维持90S；汽化室温度250、检测器温度300；载气为氢气(2mL/min)、尾吹气为氮气(30mL/min)；柱前压l0.00 psi(1psi= 6.895kPa)；进样量ll，进样分流比100:l19。气相色谱系统采用的是美国Agilent 6890型（Agilent Chromatograph: GC），包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；分析软件应用美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件MIS4.5（Microbial Identification System）和 LGS4.5（Library Generation Software）。（2）尖孢镰刀菌脂肪酸特征图谱分析选择尖孢镰刀菌脂肪酸指纹图谱匹配率最高菌株的图谱作为模式图谱，说明尖孢镰刀菌脂肪酸种类、特征、种类鉴定参数等。对被测的22株菌株的脂肪酸特征峰的百分比含量，用DPS软件进行方差分析21。（3）尖孢镰刀菌不同寄主脂肪酸生物标记分布通过MIDI系统检测得到的色谱图和信息表，汇总测试菌株的所有色谱峰(Peak Name)，以Pecent作为含量，分析尖孢镰刀菌不同寄主的脂肪酸分布的种类及含量。（4）尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记聚类分析以脂肪酸为样本，以菌株为指标，构建聚类分析数据矩阵，数据中心化，以兰氏距离为相关尺度，以类平均法为聚类方法，通过DPS软件对22株尖孢镰刀菌脂肪酸色谱结果进行聚类分析，分析尖孢镰刀菌脂肪酸的同质性。（5）尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记寄主关系以脂肪酸种类为指标，以菌株的寄主来源为样本，构建分析矩阵，以数据进行规格化转化，马氏距离为相关尺度，以可变平均法进行聚类。分析尖孢镰刀菌脂肪酸与寄主的关系。（6）尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的主成分分析以脂肪酸为样本，以菌株为指标，构建矩阵，进行主成分分析。通过主成分分析选择尖孢镰刀菌脂肪酸的特征脂肪酸，以累计特征值大于90%为指标，在因子得分矩阵中，从各脂肪酸组中选择一个因子得分总和最高的脂肪酸，组成尖孢镰刀菌脂肪酸中的特征脂肪酸。（7）尖孢镰刀菌种下分化脂肪酸型的判别模型的建立以特征脂肪酸为样本，以，以主成分分析结果得到的选出的特征脂肪酸为指标（Xj），被测的尖孢镰刀菌菌株（Xi）为样本，尖孢镰刀菌寄主级别（Y）为测定值，利用判别分析建立尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸判别模型，组建判别分析数据矩阵如下：X11X12X1jY1 X21X22X2jY2Xi1Xi2XijYi 其中j为脂肪酸峰序号，i为寄主类别序号。用Bayes逐步判别方法建模，多组逐步判别分析是按照Bayes准则,用WILKS 统计量从M个因子中，根据各因子判别能力大小的显著性检验结果，精选出若干判别能力大的且配合较好的因子，建立Bayes判别函数。Bayes判别函数方程： （i=1, 2, , p）其中：当：，则将个体x划入第i类。判别值的后验概率为：聚类分析、主成分分析、判别分析采用DPS数据处理系统进行计算21。2结果与分析2.1尖孢镰刀菌专化型菌株的脂肪酸模式图谱分析选择尖孢镰刀菌841菌株作为模式菌株。气相色谱典型的模式图见图1。从图中可以看出，除第一个溶剂波峰外，其余每一个波峰代表一种脂肪酸，该菌株具有4个特征性色谱峰，其它波峰为非优势脂肪酸。4个特征性色谱峰的保留时间分别为：（1）C16:0，10.9000.100min；（2）C18:2 CIS9,12/18:0a，13.9000.100min；（3）C18:1 CIS 9 (9c)，14.4000.100min；（4）C18:0，14.4000.100min。在第一个溶剂波峰与C16:0之间还会出现1-2个小峰，在C18:0波峰后部份菌株会出现1-2个小峰。色谱的有效峰从保留时间1.729起点到保留时间14.46为终点，共7个峰，每个峰代表一类脂肪酸。不同的菌株，峰的数量、峰值大小和脂肪酸种类不同。大部分菌株鉴定用的脂肪酸峰从十四碳脂肪酸（C14:0）开始，到十八碳脂肪酸（C18:0）结束。图1尖孢镰刀菌841脂肪酸气相色谱典型的模式图横坐标表示色谱分析时间(min)，纵坐标表示色谱峰高值；第一个色谱峰为溶剂波峰表2则为该尖孢镰刀菌PFLAs标记的信息表，是将图1中的气相色谱图信息进行量化，转化成数据形式。其中，retention time (RT)表示各PLFAs特征峰的保留时间；Response表示各PLFAs特征峰的峰面积，体现了各PLFA的含量；area/ height ratio（Ar/Ht）表示峰面积/峰高度比值；RFact表示相关因子系数；the equivalent chain length (ECL)表示各磷脂脂肪酸的相对链长度；Peak Name指各磷脂脂肪酸特征峰名称；Percent是指磷脂脂肪酸各特征峰占总脂肪酸的百分数，Comment1、Comment2分别表示误差注释和鉴定参考峰注释。MIDI系统一般通过各磷脂脂肪酸特征峰的种类和百分比含量进行菌株鉴定，在实验中，我们一般应用Peak Name和Percent来分析不同寄主专化型尖孢镰刀菌的脂肪酸组成特点。表2 尖孢镰刀菌菌株841脂肪酸气相色谱典型的模式图对应的分析结果RTResponseAr/HtRFactECLPeak NamePercentComment1Comment21.7293.652E+80.027-7.011SOLVENT PEAK- min rt7.64816380.0381.05214.00014:00.66ECL deviates 0.000Reference -0.00210.62136050.0410.88715.82016:1 Cis 9 (w 7)1.23ECL deviates 0.00310.927651360.0430.87416.00016:021.93ECL deviates 0.000Reference -0.00313.9781269560.0480.77717.72718:2 CIS 9,12/18:0a37.97ECL deviates 0.00714.0621073320.0490.77417.774Sum In Feature 832.00ECL deviates 0.00118:1 CIS 9 (w 9) 14.464211150.0460.76318.00018:06.21ECL deviates 0.000Reference -0.003-107332-Summed Feature 832.0018:1 CIS 9 (w 9) 18:1 (w 8) 2.2尖孢镰刀菌专化型不同寄主脂肪酸生物标记测定分布根据上述脂肪酸测定数据的分析结果，将供试的22株尖孢镰刀菌脂肪酸分布情况见表3。共检测到8种脂肪酸。其中脂肪酸16:0、18:0 和18:2 CIS 9,12/18:0a在所有的菌株中都存在，脂肪酸16:0的含量在16.7%-24.17%之间，脂肪酸18:0的含量在3.98%-10.92%之间，脂肪酸18:2 CIS 9,12/18:0a 的含量在32.55%-58.71%之间，各菌株三种脂肪酸之和占总脂肪酸含量的60%以上，为主要脂肪酸。脂肪酸16:1 CIS 9 (W 7)在18个菌株中存在，含量在0-1.59%；脂肪酸14:0在12个菌株中存在，含量在0.53%-1.72%；脂肪酸13:0 2OH、15:1 ISO G和17:0分别仅在1个菌株中检测到，含量均低于1%。表3 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记寄主菌株编号采集地点脂肪酸含量（%）13:0 2OH14:015:1 ISO G16:016:1 CIS 9 (W 7)17:018:018:2 CIS 9,12/18:0a 西瓜134永泰00.67022.190.9806.2839.33西瓜136永泰00.58022.881.0006.6641.57西瓜137永泰00.53023.950.8208.3939.72西瓜138永泰00016.990.8805.6148.95西瓜140永泰0.501.650.9021.171.1603.9839.63西瓜141永泰00021.200.0005.4049.19香蕉378漳州00.64023.521.3208.1532.86香蕉384漳州00023.570.8808.6032.55香蕉386漳州00020.321.090.566.6345.75香蕉387漳州00023.341.1706.7843.59香蕉389漳州00024.170.0008.4536.70香蕉391漳州00020.701.0205.6839.10香蕉392漳州00018.950.7508.6236.68花生816泉州00.55020.810.8607.3935.71花生833惠安00.79020.531.31010.9235.04花生834惠安00.00022.001.5909.8036.94花生836惠安01.56021.931.2706.6841.09花生841惠安00.66021.931.2306.2137.97花生846惠安00.00021.891.5309.6537.81花生847惠安01.11016.700.0004.8358.71花生855惠安01.72019.180.0005.0938.59花生866惠安00.55017.581.0406.3036.582.3基于尖孢镰刀菌专化型的脂肪酸生物标记聚类分析以脂肪酸为样本，以在菌株中存在情况指标，构建分析矩阵，以兰氏距离为相关尺度，以最长距离法进行聚类，分析结果见表4及图2 。当=20.78时，可将8个脂肪酸分布情况分为3个类群。类群为偶现脂肪酸类型，包括脂肪酸13:0 2OH、15:1 ISO G和17:0，分别仅在1个菌株中出现。类群为不完全分布脂肪酸类型，即该类中的脂肪酸仅在部分被测菌株中出现，它们包括了脂肪酸14:0和16:1 CIS 9 (W 7)，分别在12个菌株和18个菌株中分布。类群为完全分布脂肪酸类型，即该类中的脂肪酸在全部被测菌株中出现，它们包括了脂肪酸16:0、18:0和18:2 CIS 9,12/18:0a，在22个菌株中均有分布，且在各菌株中含量之和大于60%，为主要脂肪酸。通过对尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记聚类分析可知，3个偶现脂肪酸生物标记，对与寄主的关系不密切，在以下分析尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记寄主关系过程，将剔出这3条脂肪酸生物标记。表4聚类过程脂肪酸图2 脂肪酸分布情况聚类结果TIJ距离1310.2857126123847.8656645214.7231757418.0494662121.3975974125.975082.4尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记寄主关系以脂肪酸为指标，以寄主来源为样本，构建分析矩阵，数据进行规格化转化，马氏距离为相关尺度，以可变平均法进行聚类，分析结果见表5及图3。当=17.22时，可将22株供试菌株分为2个类群。类群包括10株尖孢镰刀菌，6株来源于西瓜，4株来源于香蕉。类群包括5株尖孢镰刀菌，2株来源于香蕉，3株来源于花生。类群包括7株尖孢镰刀菌，其中6株来源于花生，1株来源于香蕉。来源于西瓜和花生的镰刀菌大部分在同一类中，并分布在聚类的上下区域，而来源于香蕉的菌株分布在聚类图的中间区域，并有部分穿插在西瓜和花生中，可见尖孢镰刀菌的寄主也具有过渡寄主，香蕉为尖孢镰刀菌寄主西瓜和花生的过渡性寄主。表5T I J 距离 G11=28.701730.61 2210.83 3960.89 422210.96 517111.29 6541.82 71062.18 820162.25 921132.78 10413.06 1114123.36 12864.19 13314.88 1419165.76 15616.13 1618117.27 1712119.11 18151311.78 1911113.41 20161315.79 2113128.70 图3 不同寄主尖孢镰刀菌脂肪酸聚类图当=20.78时，可将8个脂肪酸分布情况分为3个类群。类群为偶现脂肪酸类型，包括脂肪酸13:0 2OH、15:1 ISO G和17:0，分别仅在1个菌株中出现。类群为不完全分布脂肪酸类型，即该类中的脂肪酸仅在部分被测菌株中出现，它们包括了脂肪酸14:0和16:1 CIS 9 (W 7)，分别在12个菌株和18个菌株中分布。类群为完全分布脂肪酸类型，即该类中的脂肪酸在全部被测菌株中出现，它们包括了脂肪酸16:0、18:0和18:2 CIS 9,12/18:0a，在22个菌株中均有分布，且在各菌株中含量之和大于60%，为主要脂肪酸。通过对尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记聚类分析可知，3个偶现脂肪酸生物标记，对与寄主的关系不密切，在以下分析尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记寄主关系过程，将剔出这3条脂肪酸生物标记。2.45尖孢镰刀菌专化型脂肪酸生物标记的主成分分析（要用全部脂肪酸数据分析，尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的主成分分析分析结果见表6。前四四个主成分的特征值的累计百分比达93.91%，表明前四个主成分代表了总体信息量的90%以上。规格化特征向量见表7，有5个因子，分别为因子1（14:0），因子2（16:0），因子3（16:1 CIS 9 (W 7)），因子4（18:0），因子5（18:2 CIS 9,12/18:0a）；它们的特征向量均值分别为0.12，0.13、0，0.03，0.16，0.30。主成分分析结果得到尖孢镰刀菌脂肪酸中的特征脂肪酸有55个，分别为14:0，16:0，16:1 CIS 9 (W 7)，18:0和18:2 CIS 9,12/18:0a。表6 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记主成分分析特征值No特征值百分率%累计百分率%12.4148.2348.2321.0320.5268.7530.7514.9783.7240.5110.1993.9150.306.09100.00表7 规格化特征向量:因子x(1)x(2)x(3)x(4)x(5)总和均值因子1 -0.27 0.44 0.42 0.54 -0.52 0.6012 因子2 0.86 0.13 0.25 -0.22 -0.36 0.6513 因子3 -0.04 -0.69 0.72 0.08 0.10 0.1503 因子4 -0.17 0.53 0.50 -0.50 0.43 0.8016 因子5 0.39 0.18 0.03 0.64 0.64 10.9038 2.5基于尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记的尖孢镰刀菌寄主专化型聚类分析关系根据主成分分析的结果，选择主成分分析结果得到尖孢镰刀菌脂肪酸中的5个特征脂肪酸，即14:0、16:0、16:1 CIS 9 (W 7)、18:0和18:2 CIS 9,12/18:0a，构建矩阵，以脂肪酸为指标，以寄主来源为样本，数据进行规格化转化，马氏距离为相关尺度，以可变平均法进行聚类，分析结果见表5及图3。当1=28.70时，可将22株供试菌株分为2个类群。类群包括15株尖孢镰刀菌，6株来源于西瓜，5株来源于香蕉，3株来源于花生。类群包括7株尖孢镰刀菌，1株来源于香蕉，6株来源于花生。在类群I中，还可以分为三个亚群S1、S2、S3；在S1 亚群中，5株来源于西瓜，1株来源于香蕉；在S2亚群中，1株来源于西瓜，3株来源于香蕉；在S3亚群中，2株来源于香蕉，3株来源于花生。从聚类分析的结果可以看出，寄主为西瓜和花生的尖孢镰刀菌是聚类的两个极端，寄主为香蕉的尖孢镰刀菌，分布在聚类图的中间区域，并有部分穿插在西瓜和花生中，可见在尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记为指标的进化过程，来自香蕉的尖孢镰刀菌起着在西瓜和花生的尖孢镰刀菌之间的过渡性进化作用。当1=28.70时，可将22株供试菌株分为2个类群。类群包括15株尖孢镰刀菌，6株来源于西瓜，5株来源于香蕉，3株来源于花生。类群包括7株尖孢镰刀菌，1株来源于香蕉，6株来源于花生。在类群I中，还可以分为三个亚群S1、S2、S3；在S1 亚群中，5株来源于西瓜，1株来源于香蕉；在S2亚群中，1株来源于西瓜，3株来源于香蕉；在S3亚群中，2株来源于香蕉，3株来源于花生。从聚类分析的结果可以看出，来致于寄主为西瓜和花生的尖孢镰刀菌是聚类的两个极端，来致于寄主为香蕉的尖孢镰刀菌，分布在聚类图的中间区域，并有部分穿插在西瓜和花生中，可见在尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记为指标的进化过程，来致自香蕉的尖孢镰刀菌起着在西瓜和花生的尖孢镰刀菌之间的过渡性进化作用。表5T I J 距离 S3S2S1G2G11=28.701730.61 2210.83 3960.89 422210.96 517111.29 6541.82 71062.18 820162.25 921132.78 10413.06 1114123.36 12864.19 13314.88 1419165.76 15616.13 1618117.27 1712119.11 18151311.78 1911113.41 20161315.79 2113128.70 图3 不同寄主尖孢镰刀菌脂肪酸聚类图2.6不同寄主尖孢镰刀菌专化型电子舌鉴别脂肪酸生物标记判别模型的建立2.6.1不同寄主尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记判别模型的原始数据及已知分类以主成分分析结果选出的特征脂肪酸包括14:0，16:0，16:1 CIS 9 (W 7)，18:0，18:2 CIS 9,12/18:0a为指标（Xj），尖孢镰刀菌的寄主西瓜，香蕉和花生为样本，寄主为西瓜，香蕉和花生，寄主类别（Y）为测定值，其中定义西瓜为寄主类别1，香蕉为寄主类别2，花生为寄主类别3，组建判别分析数据矩阵见表8。表8 尖孢镰刀菌寄主专化型判别分析矩阵寄主采集地点菌株编号脂肪酸含量（%）寄主类别14:016:016:1 CIS 9 (W 7)18:018:2 CIS 9,12/18:0a西瓜永泰1340.6722.190.986.2839.331西瓜永泰1360.5822.881.006.6641.571西瓜永泰1370.5323.950.828.3939.721西瓜永泰1380.0016.990.885.6148.951西瓜永泰1401.65839.631西瓜永泰1410.0021.200.005.4049.191香蕉漳州3780.6423.521.328.1532.862香蕉漳州3840.0023.570.888.6032.552香蕉漳州3860.0020.321.096.6345.752香蕉漳州3870.0023.341.176.7843.592香蕉漳州3890.0024.170.008.4536.702香蕉漳州3910.0020.701.025.6839.102香蕉漳州3920.0018.950.758.6236.682花生泉州8160.5520.810.867.3935.713花生惠安8330.7920.531.3110.9235.043花生惠安8340.0022.001.599.8036.943花生惠安8361.5621.931.276.6841.093花生惠安8410.6621.931.236.2137.973花生惠安8460.0021.891.539.6537.813花生惠安8471.1116.700.004.8358.713花生惠安8551.7219.180.005.0938.593花生惠安8660.5517.581.046.3036.583按照Bayes准则，采用Bayes逐步判别分析，当Fa临界值=0.40时，尖孢镰刀菌寄主专化型判别分析特征脂肪酸14:0，16:0，16:1 CIS 9 (W 7)，18:0，18:2 CIS 9,12/18:0a在三个寄主专化型类别中的平均值各个因子分类均值见表9.。第一类即菌株寄主为西瓜时，五个因子（X1，X2，X3，X4，X5）即脂肪酸14:0，16:0，16:1 CIS 9 (W 7)，18:0，18:2 CIS 9,12/18:0a的均值分别为0.57，21.40，0.81，6.05，43.07；第二类，即菌株寄主为香蕉时，脂肪酸14:0，16:0，16:1 CIS 9 (W 7)，18:0，18:2 CIS 9,12/18:0a的均值为0.09 ，22.08，0.89，7.56，38.18；第三类，即菌株寄主为花生时，脂肪酸14:0，16:0，16:1 CIS 9 (W 7)，18:0，18:2 CIS 9,12/18:0a的均值0.77，20.28，0.98，7.43，39.83。各个因子类内离差（W）矩阵和总离差（T）矩阵见表10和表11，。表9尖孢镰刀菌寄主专化型判别分析各个因子分类均值:寄主 14:016:016:1 CIS 9 (W 7)18:018:2 CIS 9,12/18:0a西瓜0.57 21.40 0.81 6.05 43.07 香蕉 0.09 22.08 0.89 7.56 38.18 花生0.77 20.28 0.98 7.43 39.83 表10尖孢镰刀菌寄主专化型判别分析各因子类内离差(W)矩阵:因子X1X2X3X4X5X1（14:0）5.12 0.07 -0.84 -8.07 -2.46 X2（16:0）0.07 86.56 6.49 33.97 -132.35 X3（16:1 CIS 9 (W 7)）-0.84 6.49 4.85 6.68 -25.80 X4（18:0）-8.07 33.97 6.68 57.45 -103.02 X5（18:2 CIS 9,12/18:0a）-2.46 -132.35 -25.80 -103.02 689.13 表11总离差(T)矩阵:因子X1X2X3X4X5X1（14:0）6.98 -4.60 -0.66 -9.03 3.65 X2（16:0）-4.60 99.76 5.65 32.84 -138.39 X3（16:1 CIS 9 (W 7)）-0.66 5.65 4.96 7.47 -27.54 X4（18:0）-9.03 32.84 7.47 66.47 -128.63 X5（18:2 CIS 9,12/18:0a）3.65 -138.39 -27.54 -128.63 768.32 2.6.2 尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记各寄主判别模型经逐步判别计算得尖孢镰刀菌脂肪酸生物标记各寄主判别模型见表12，其中引入与剔除变量的临界值取F1=F2=0.4，有4个因子分别为X1（14:0），X2（16:0），X4（18:0），X5（18:2 CIS 9,12/18:0a）入选。入选变量和判别模型的判别教过经卡方检验得到X2=15.585，P=0.04446，说明引入的四个变量X1（14:0），X2（16:0），X4（18:0），X5（18:2 CIS 9,12/18:0a）建立的判别模型对判别尖刀镰孢菌三种寄主在检验水平=0.01下，效果显著，因此尖刀镰孢菌脂肪酸14:0， 16:0， 18:0， 18:2 CIS 9,12/18:0a是判别尖孢镰刀菌寄主的四个重要指标。表12 尖孢镰刀菌各寄主的判别模型寄主判别模型西瓜Y1=-183.06+12.24X1+8.05X2+5.39X4+3.58X5香蕉Y2=-174.09+10.40X1+7.96X2+5.40X4+3.42X5花生Y3=-173.97+14.85X1+7.25X2+6.58X4+3.53X5当卡方值=15.858, P=0.04446时，有4个因子分别为X1（14:0），X2（16:0），X4（18:0），X5（18:2 CIS 9,12/18:0a）。为入选情况见表12。其中入选因子的Fa值分别0.62，0.76， 0.73，0.93 入选状态值分别为4.8712 (已入选) ，2.5341 (已入选) ，2.9708 (已入选)，0.5922 (已入选) 。两两分类间判别效果检验见表13 。计算结果建立的判别模型如下：Y1=-183.06+12.24X1+8.05X2+5.39X4+3.58X5Y2=-174.09+10.40X1+7.96X2+5.40X4+3.42X5Y3=-173.97+14.85X1+7.25X2+6.58X4+3.53X52.76.3 尖孢镰刀菌专化型电子舌鉴别模型精确度分析回判结果如果将表8的原始数据代入表12中的各判别函数，式中X1代表脂肪酸14:0，X2代表脂肪酸16:0，X4代表脂肪酸18:0,，X5代表脂肪酸18:2 CIS 9,12/18:0a，Yi代表菌株的寄主类别。判别效果矩阵分析见表14，计算后分类和后验概率见表15.。其中类型1即寄主为西瓜的原6株菌株，判别分析后全部为类型1，正确率为100%；原来类2的7株菌株，经判别分析后得到6株为类2，1株为类3，正确率为85.71%，原类3的9株菌株，经判别分析后得到1株为类1，8株为类3，正确率为88.89%,.。改判别函数对尖刀镰孢菌寄主专化型的判对概率为90.909%，对于22株镰刀菌的寄主专化型的判别，错误的有2个，分别为13和18号菌株，判别错误级别不算高，因为香蕉寄主专化型属于过渡型，