一种高效空气传播病毒采样器的开发.docVIP

一种高效空气传播病毒采样器的开发摘要：通过设计运行程序和采样装置，开发了一种便携高效的病毒采样器，运行程序采用单片机自动化控制，可实时显示采样速度、预置采样量和剩余采样量。采样装置采用鼓泡式吸附，并选用壳聚糖和DEAE阴离交换树脂作为吸附剂。另外，设计出操作方便快捷的采样筒装置，实现了吸附、洗脱一体化。查找出H1N1病毒和H5N1的保守序列并设计引物，对公交车、医院等人口密集的地方进行样品采集并采用荧光定量PCR检测。结果显示，病毒采样器结合荧光定量PCR能检测到的空气中最低H5N1和H1N1流感病毒浓度分别为46个/L和98个/L。关键词：鼓泡式，壳聚糖，保守序列，荧光定量PCR前言病人是流感的主要传播源，流感病毒主要潜伏在病人的鼻涕、痰和唾液中，流感病毒主要通过空气飞沫和接触传播1,2。流感病毒主要借助空气传播，患者通过咳嗽、打喷嚏、甚至大声说话时都会随唾液飞沫、尘埃例子等，将病毒扩散到周围的空气中，随空气流动传播。患者通过呼吸吸入、眼睛结膜，或接触过的物体表面附着的病毒再用手触摸鼻子、眼睛、嘴，造成病毒感染3,4,5。 随着社会的发展，不同国家、地区人们的交往越来越频繁，因此飞机、火车、公交车、学校、车站、机场、银行、医院等人口密集封闭的场所已经成为流感传播的主要地方6,7。公共场所病毒的检测，可为流感的预防及提供应急措施，提供极为关键的参考数据。但是流感病毒的检测，由于受到空气中样品采集的制约，空气中流感病毒的检测目前还是一个难题。H1N1流感病毒（猪流感）、H5N1流感病毒、普通感冒病毒、SARS病毒、EB病毒（导致鼻咽癌）、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等通过空气传播的与人类疾病密切相关的病毒达几十种之多1,8,9。为能快速检验特定空间的空气质量，本项目开发出高效的流感病毒空气采样器，结合目前已经成熟的荧光定量PCR技术，可快速检、灵敏地检测出空气中可能存在的流感病毒。该装置主要由负压吸气装置、空气计量器、及病毒吸附液及吸附粒子组成。利用抽气装置，通过负压吸附空气，以每分钟恒定气流量，经过液体采集区，在溶液和溶液内的流感病毒特异性吸附粒子的吸附用下，使空气中的病毒粒子收集在小体积的液体中。然后通过过滤或离心，收集液体中的粒子，用市售的RNA萃取试剂盒萃取病毒mRNA，然后采用国家标准或公认的检测技术如荧光定量PCR检测病毒量9,10,11，病毒测定的拷贝数除以吸附的空气体积，即检测所得的单位空气中的病毒数。检测灵敏度可达到1050个病毒/米3空气。对于空气中较低密度的病毒，由于空气在较小体积的液体中的停留时间等因素的限制，无法捕集微小病毒粒子。本技术通过在液体体系中添加特异性流感病毒吸附纳米粒子，可有效提高病毒的吸附效率。由于市场上目前还未有针对空气中病毒采样的高灵敏度专用装置，因此本装置及病毒吸附剂可填补国际上该领域的空白。1 病毒采样器设计1.1 工作原理仪器结构由采样筒、隔膜泵、电子时控电路、LCD显示电路、电源和壳体等部分组成。工作前，将适量阴离子交换树脂和吸附液加入吸附筒中，连接好装置，在目的地打开电源开关，设置所需采样体积和采样速率。在真空泵作用下，空气经采集口和管路，进入采样筒，空气中的颗粒和阴离子交换树脂充分接触而被吸附。到达设定采样量后，采样自动结束。通过离心或过滤收集吸附剂，然后加入适量洗脱液将可能吸附到的病毒颗粒洗脱下来。1.2 装置设计1.2.1 内部结构设计装置内部结构主要包括隔膜真空泵、充电电源、空气流量计、主控电路板、液晶显示屏电路板及按纽输入电路板等。真空泵采用PM系列PM6503型气体采样泵。特点：无污染传输，免维护；可以任意方向安装；允许介质富含水汽；可以24小时连续运转；小体积，低能耗。使用直流电源，额定电压为12伏。电源选用免维护铅酸蓄电池，提供12伏电压，额定容量达1.3AH，保证仪器正常持久运行。空气流量计采用LZB-6WB型玻璃转子流量计。该流量计可以检测空气流量范围为60600L/h，锥管长度为160mm，具有小巧的外形，精度等等级为2.5，带针形调节阀，广泛用于各种分析仪器、环境保护设备、医疗设备及其它实验仪器配套。液晶显示屏电路板使用12864图形点阵液晶显示模块，带负压，不带背光，ks0108控制器，兼容hd61202，不带字库。外型尺寸 93mm70mm，工作电压：5.0V。主控电路板使用STC89C52RC单片机，可完全满足仪器工作程序控制要求3。按键输入电路板上设计安装有六个操作键，分别为选择键、返回键及四个方向键。主控电路板与按键输入电路板外型尺寸均为80mm60mm。1.2.1.1 电路设计电路原理框图如图1，由时基电路提供脉冲信号经分频器传输到单片机中。按键输入电路用于设定采样速度和采样量，控制仪器工作状态。按下按键时，程序将此键转换成对应的数字键值，将按键输入信号传输到单片机中进行时控处理，然后将计算结果经放大电路后，驱动隔膜泵的直流电机，从而控制泵的工作状态。LCD显示电路可以显示当前工作状态，包括采样速度、预置采样量及剩余采样量等。 图1 电路原理框图图2 电路结构实物图1.2.1.2 软件设计采样器主流程图如图3。程序开始，对内部寄存器进行初始化，显示启动画面。键盘扫描程序如图4，此程序动态扫描键盘，当有按键按下时，将此键转换成对应的数字键值，对采样器工作状态进行设置。函数模块控制仪器运行，LCD显示仪器工作状态。采样空气量到达预设值，即剩余采样量为零时真空泵自动停止工作。 图3 采样器主流程图 图4 键盘扫描程序流程图1.2.2 外部结构设计如图5所示，仪器壳体外部结构包括：1液晶显示屏、2六个操作键、3支架、4采样筒、5进气管道、6过滤器、7电源开关、8排气口、9充电接口。采样时，取下过滤器6，采样筒中加入适量含有病毒吸附剂的采样液，然后倒置，再接上过滤器6，放置于支架3上。空气通过采样筒进气端两个细小进气管道5时分散成微小液泡，极大地增加了吸附剂悬浊液与病毒气溶胶的接触面积。采样结束后，可直接将多余的液体排出，而吸附了病毒的吸附颗粒则被阻留在采样筒中；然后加入适量脱脱液，充分混匀后推动活塞将含有病毒粒子的液体排出并收集，而吸附剂因粒径比过滤器6的膜孔径大而留在筒中。 图5 病毒采样器外部结构示意图2 采集介质2.1 采集介质制备荷电材料的分子结构中带有某种固定电荷，通过正负电荷的相互吸引原理可吸附分离带相反电荷的物质。细菌、病毒等微生物等电点一般在pH25之间，自然环境下带负电荷。本采样器采样液中的吸附剂由带有正电荷的荷电材料制备，可静电吸附带负电荷的病毒。通过调节 pH 值或向水样中加入多价盐离子可改变病毒表现所带的电荷量，从而改变吸附剂与病毒的吸附强度4。壳聚糖是一种天然高分子聚合物，属于氨基多糖，学名为（1，4）-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，壳聚糖分子中的氨基质子带正电荷，是至今为止唯一发现的带阳离子性质的碱性多糖。甲壳素经NaOH处理脱乙酰化后用醋酸或浓硫酸溶解，调节溶液PH至大量沉淀产生，用PH5.06.0的缓冲液洗涤沉淀并保存在缓冲液中备用。DEAE-sepharose fast flow为市售弱阴离子交换树脂。2.2 采集介质富集效果将克隆有H5N1血细胞凝集素的质粒溶液喷雾到一较大密闭的容器中，同时用真空泵将容器中空气抽出分别经由等量0.05g/mL消泡剂、保护剂（BSA）、活性炭、乙二醇、壳聚糖、DEAE、壳聚糖/DEAE混合物组成的溶液和蒸馏水吸附后，离心收集并洗涤沉淀，所得沉淀物直接用Trizol试剂提取病毒总RNA，琼脂糖电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计定量，检验纯度。反转录按照反转录试剂盒步骤进行。Real-Time PCR所用引物为：H5N1上游引物序列：5-ACATATGACTACCCACAGTATTCAG-3H5N1下游引物序列：5- AGACCAGCTACCATGATTGC-3以不吸附的病毒液PCR结果最为参考，并以一条模板作为一个病毒颗粒计，对比几种吸附剂的吸附效果，实验结果如图6：图6 不同吸附剂对病毒颗粒的吸附效果由图6可看出壳聚糖和DEAE对病毒颗粒的吸附效果较理想，而且由壳聚糖/DEAE组成的混合物吸附效果最好，与对照相比，吸附率为75%，由于喷雾和吸附过程中病毒颗粒损失较多，吸附剂对病毒的吸附率很难高于80%。故本实验选择壳聚糖/DEAE组成的混合物作为吸附介质。由于DEAE在鼓泡式吸附过程中会粘在采样筒壁上，因此采集介质以壳聚糖为主，DEAE为辅。当采集空气体积较大，时间较长时可只用壳聚糖作为采集介质。3 定量PCR检测流感病毒3.1 材料与方法3.1.1 仪器与试剂7300实施荧光定量PCR系统（Applied Biosystems），全自动凝胶成像分析系统，冷冻离心机，超净工作台，核酸电泳仪，紫外分光光度计（美国VARIAN公司），甲壳素，DEAE-sepharose fast flow，BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas），Trizol，PET-H5N1质粒。3.1.2 病毒总RNA提取，反转录PCR及Real-Time PCR采样结束后，推动采样筒滤掉采集液，收集采集介质，蒸馏水洗涤3次，离心收集沉淀。用Trizol试剂提取病毒总RNA，琼脂糖电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计定量，检验纯度。反转录按照反转录试剂盒步骤进行。Real-Time PCR所用引物：H1N1上游引物序列：5-GCCAAAAGACCCAAAGTA-3H1N1下游引物序列：5-CCTATTGTGACTGGGTG-3H5N1上游引物序列：5-ACATATGACTACCCACAGTATTCAG-3H5N1下游引物序列：5- AGACCAGCTACCATGATTGC-3用H5N1保守序列作为内参。3.2 结果3.2.1 病毒采样器实物制作图7 病毒采样器实物图 图8 病毒采样器改装后实物图3.2.2不同地点采样结果荧光定量PCR检测通过对公交车、医院等人口密集、通风条件较差的地点采样并用荧光定量PCR检测病毒量。荧光定量PCR检测H1N1和H5N1的熔解曲线和扩增曲线如图9-12：图9 公交车采集H1N1熔解曲线和扩增曲线图10 公交车采集H5N1熔解曲线和扩增曲线图11 医院候诊室采集H1N1熔解曲线和扩增曲线图12 医院候诊室采集H5N1熔解曲线和扩增曲线结果显示，某公交车内空气中H1N1的浓度为5.60103个/L，H5N1的浓度为1.18104个/L ，医院候诊室内空气中H1N1的浓度为2.20104个/L ，H5N1的浓度为2.51104个/L。3.3.3 采样器灵敏度的评估检测到流感病毒后采用梯度减小采样量的方法来评估此种检测方法的灵敏度，最后以能够检测出的最低病毒浓度作为空气中病毒采样器结合荧光定量PCR检测下限即灵敏度。荧光定量PCR检测到的空气中最低病毒浓度时的熔解曲线和扩增曲线如图13-14：图13 医院候诊室采集H5N1最低浓度时的熔解曲线和扩增曲线图14 公交车采集H1N1最低浓度时的熔解曲线和扩增曲线结果显示，采集到空气中H5N1流感病毒的最低检测浓度为46个/L，H1N1流感病毒的最低检测浓度为98个/L，该采样器结合荧光定量PCR检测空气中的流感病毒具有很高的灵敏性，可为流感及其它靠空气传播病毒的预防、空气质量评价提供重要的参考数据。3.3.4 H1N1和H5N1凝胶电泳检测将荧光定量PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图13、14：我们设计的H1N1保守序列长度为260bp，H5N1保守序列长度为153bp，电泳结果显示PCR产物条带大小正确。3.3.5 H1N1和H5N1测序鉴定为了进一步验证所检测目的条带的正确性，将v和H5N1的PCR产物送至上海生工测序。测序结果所得H1N1序列与之前所查找的H1N1保守序列进行BLAST比对，比对结果显示99.23%的一致性。测序结果所得H5N1序列与之前所查找的H5N1保守序列进行BLAST比对，比对结果显示完全一致。4 微生物检测空气采样过程同上，将收集并洗脱的滤液稀释一定倍数后涂平板，同时设置空白组（直接用蒸馏水涂平板）和自然沉降组（将倒有LB的平皿直接暴露在相同的空气环境中，并与空气采集器采集时间相同），然后将三组平皿置于37培养1,3，12h后计数并扣除空白组菌落数。实验结果如表1所示：表1 空气微生物采集菌落数实验次数自然沉降组菌落数采样器采集组菌落数1214742145050032174133结果显示，病毒采集器对微生物的采集效率比自然沉降法对微生物的采集效率最高可达3600多倍，说明病毒采集器对微生物的采集比自然沉降法具有明显的优势。讨论流感一直是全球关注的热点，而引起流感的罪魁祸首便是流感病毒，它们主要借助空气传播，因此开发出能够有效准确检测空气中流感病毒十分重要。空气中微生物的采样方法主要有自然沉降法和仪器采样法。由于病毒分子颗粒较小，一般很难用自然沉降法采集，所以运用较多的是仪器采样法。仪器采样法是借助空气微生物采样器的外力作用，在一定时间内将生物粒子收集浓缩，用校正公式计算出空气中微生物的粒子浓度（CFU/m3），然后对空气微生物进行分离、纯化、检验和鉴定4。影响采样效率一个很重要的因素是吸附剂的特性，因此选择一种吸附效率高，特异性强的吸附剂十分关键。细菌、病毒等微生物等电点一般在pH25之间，自然环境下带负电荷。选择分子结构中带有正电荷的荷电材料，通过正负电荷的相互吸引原理可吸附带相反电荷的颗粒。通过调节 pH 值或向水样中加入多价盐离子可改变病毒表面所带的电荷量，从而改变吸附剂与病毒的吸附强度5。我们首选筛选出一种能有效吸附病毒的壳聚糖和DEAE阴离子交换树脂，设计了一种较为简单的采样模型，然后结合荧光定量PCR的高特异性和精确度检测出了特定空间空气中病毒量。最后我们结合电路学知识设计出了便携的病毒采样器模型，成功地开发出了一种空气中病毒采样器。用病毒特异性吸附粒子富集病毒并结合荧光定量PCR检测空气中病毒量。吸附介质对病毒的吸附率高达75%，对空气中H5N1流感病毒的最低检测浓度为46个/L，H1N1流感病毒的最低检测浓度为98个/L。由于在病毒采集、洗脱、mRNA提取、逆转录、荧光定量PCR等过程中病毒或其mRNA会有损失，同时受到仪器精度的影响，因此我们检测出的病毒量比实际采样点空气中病毒量偏小，但我们的结果仍能为空气质量评定、流感的预防及相应应急措施，提供重要的参考数据。同时对比了病毒采集器和自然沉降法对微生物的采集效率，发现病毒采集器对微生物的采集比自然沉降法具有明显的优势。参考文献1 于玺华微生物气溶胶的感染与控制-兼论SARS病毒预防J洁净与空调技术，2003，4(4)：25-292 祁建华,高会旺生物气溶胶研究进展:环境与气候效应J生态环境，2006，15(4)：854-8613 方治国，欧阳志云，胡利锋等空气微生物研究方法进展与展望J环境污染治理技术与设备，2005，6(7)：8-134 王四全，吴俊，曹玉广水体中病毒富集方法研究进展J中国公共卫生，2009，(11)5 Hogan, C. J., Jr., E. M. Kettleson, et al. (2005). Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. J Appl Microbiol 99(6): 1422-1434.6 Myatt, T. A., S. L. Johnston, et al. (2003). Airborne rhinovirus detection and effect of ultraviolet irradiation on detection by a semi-nested RT-PCR assay. BMC Public Health 3: 5.7 Maria D.King,Ben F.Thien,Suvi Tiirikainen,Andrew R.McFarland, eta1. Collection characteristics of a batch-type wetted wall bioaerosol sampling cyclone. Aerobiologia (2009)25:239-247.8 McCluskey, R., R. Sandin, et