免疫组化标准化操作方案.doc

天津赛尔生物技术有限公司免疫组化操作步骤标准化操作方案部 门： 免疫组化检测 负 责 人： 魏 华 英 制定日期： 2009年6月16日 目录一、简介-2二、实验材料-3三、实验步骤-4四、常见问题与解决方法-5免疫组化1概述及反应原理免疫组化是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。本公司采用的是免疫酶法对抗体进行检测。2 实验材料、试剂2.1组织材料 根据检测抗原在组织中的特异表达需要选取组织。2.2试剂及配方2.2.1 试剂试剂名称生产厂家纯度级别无水乙醇天津市科密欧化学试剂研发中心分析纯枸橼酸 (1H20)天津市化学试剂一厂分析纯枸橼酸三钠 (2H20)天津市化学试剂一厂分析纯30% H2O2天津市风船化学试剂有限公司分析纯DAB显色试剂盒北京中杉金桥中性树胶国药集团化学试剂有限公司分析纯二甲苯天津市科密欧化学试剂研发中心碳酸锂天津市化学试剂三厂分析纯苏木素北京化学试剂公司分析纯硫酸铝甲天津市光复科技发展有限公司分析纯氧化汞北京金星化学试剂厂分析纯2.2.2试剂配方（1）10PBS缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 80.14gKCl 2.01gNa2HPO4 15.3KH2PO4 1.904 加双蒸水至1000 ml，5N的NaOH调pH至7.27.4，过滤，室温保存备用。稀释10倍用（2）抗原修复液：0.01M 枸橼酸缓冲液 （pH6.0）： 枸橼酸 (1H20) 0.4 g 枸橼酸三钠 (2H20) 3g 加双蒸水至1000 ml，5N的NaOH调pH至6.0，现配现用。（3）3% H2O2-甲醇溶液30% H2O2: 甲醇=1：9（v:v），室温保存备用。（4）5%封闭液：1PBS 950ul加入正常羊血清50ul混匀，-20保存备用。（5）本公司制备一抗：按要求比例用1PBS稀释，现配现用。（6）与一抗相对应HRP标记二抗按要求比例1PBS用稀释，现配现用。（7）DAB显色试剂盒，4保存备用。（8）封片剂：中性树胶，室温保存备用。（9）苏木素染液 甲液：苏木精2.5g溶入25ml无水乙醇乙液：硫酸铝钾50g融入500ml蒸馏水混合甲乙液体，煮沸，缓慢加入氧化汞12.5g，冷却，过滤。 加入20ml冰醋酸，室温保存备用。（10）1%盐酸酒精盐酸 5ml无水乙醇 495ml于通风橱内将二者混合，室温保存备用，（11）梯度乙醇双蒸水与无水乙醇混合配制以下浓度乙醇：100%、95%、90%、85%、70%。室温保存备用。（12）二甲苯，室温保存备用。（13）饱和碳酸锂 碳酸锂粉剂加入1000ml双蒸水，搅拌直至饱和状态，室温保存备用。3.免疫组织化学染色操作步骤3.1 脱蜡 组织玻片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。3.2 水化 乙醇100% 10min，乙醇100% 10min， 3% H2O2-甲醇 30min，乙醇90% 10min，乙醇70% 10min，双蒸水10min。3.3抗原煮沸热修复水浴锅加热0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95左右，放入组织切片加热15分钟。PBS洗5分钟，三次。3.4封闭滴加5%正常山羊血清封闭液，室温孵育10分钟。甩去多余液体。不洗。3.5一抗孵育滴加适量已稀释一抗, 室温孵育30min，4过夜后室温孵育。设空白对照以PBS代替一抗，其他处理步骤一致。3.6二抗孵育PBS洗三次每次5分钟。滴加适合比例稀释的相应二抗,室温孵育40分钟。PBS洗3次每次5分钟。3.7 DAB显色按DAB显色试剂盒操作说明显色，镜下掌握显色程度。自来水冲洗。3.8复染苏木素复染30秒到1分钟，自来水冲洗。3.9 分化1%盐酸酒精分化1秒，饱和碳酸锂溶液返蓝。3.10 脱水 梯度乙醇（70%、85%、90%、95%、100%、100%）分别浸泡10分钟3.11 透明 组织切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。3.12 封片滴加1滴中性树胶，盖玻片从一端倾斜盖下，防止气泡产生。3.13 显微镜观察。3 结果判断阳性着色呈棕黄色。根据不同抗原的细胞定位，其棕黄色位于细胞不同位置。根据情况进行分析4常见问题与解决方法4.1 染色过强 原因解决办法抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4过夜孵育温度过高，孵育温度超过37一般室温20-28DAB显色时间过长或DAB浓度过高显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准组织变干：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失采用DAKO笔或PAPPen在组织周围画圈，可以有效的避免液体流失，提高操作速度4.2非特异性背景染色原因解决办法操作过程中冲洗不充分每步冲洗35组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长组织中含内源性生物素正常非免疫动物血清再封闭血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间4.3染色弱原因解决办法抗体浓度过低，孵育时间过短提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟试剂超过有效使用期及时更换试剂操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切