微生物量碳和酶活性的测定.doc

微生物量碳测定（此指标是反映土壤中微生物总量-群落大小的一个指标）称取经前处理相当于20-g烘干基的新鲜土样，盛装在50ml的烧杯中，放置于真空干燥器中，并放置盛有去乙醇的氯仿（约2/3烧杯）的50ml烧杯1只，烧杯内放入少量沸石(洗净烘干的瓷片，0.5mm大小)，用真空泵抽空使氯仿沸腾5分钟，关闭真空干燥器阀门，在室温避光下熏蒸24小时。熏蒸24小时结束后，打开干燥器的阀门，取出盛装有氯仿的烧杯，然后用真空泵抽空3-4次（每次抽真空后应慢慢的打开阀门），使渗透到土样中的氯仿全部被排除。熏蒸结束后将土样转移到250ml的三角瓶中，三角瓶中加入80ml 0.5M K2SO4溶液震荡1小时，用中速定量滤纸过滤，并收集滤液。重复两次。过滤时添加空白2个。提取液应立即分析，或在18下保存。在熏蒸的同时，称取另外两份鲜土样直接加入80ml 0.5M K2SO4溶液震荡1小时，后过滤收集滤液。重复两次。过滤时添加空白2个。注意，低温（18）下保存的土壤提取液，解冻后会出现一些白色沉淀，不必除去，但取样前应充分摇匀。提取液中的碳用总碳分析仪测定。（稀释20倍吸取2.5ml到50ml容量瓶，上机。）试剂准备：氯仿；硫酸钾。标准曲线：0 0.5 1 3 5微生物生物量碳 (Bc) 用下面公式计算:Bc = Fc/ Kc。式中 Fc为熏蒸与不熏蒸土壤在培养期间CO2 的释放量的差值,Kc为熏蒸杀死的微生物量中的碳在培养过程中被分解,并以 CO2 释放出来的比例, 目前一般都采用0. 45。(一般用 K2Cr2O7 氧化法测定有机碳 , Kc为0. 330. 38; TOC分析仪测定, Kc一般为0. 45 ) 酶活性的测定包括脱氢酶（Dehydrogenase），脲酶（Urease），精氨酸水解酶，碱性磷酸酯酶，b-葡萄糖酶等。脲酶（Urease）和精氨酸水解蛋白酶（N-a-benzoyl-L-argininamide, BAA）活性的测定。两种测定所用的缓冲液均是0.1M磷酸盐，pH为7。1M的尿素溶液和0.03M的BAA分别用作基质。2ml缓冲液和0.5ml基质溶液加入0.5g的土壤中，在30度（脲酶）或者39度（蛋白酶）下恒温培养90min。两种酶的活性均以水解反应中形成的NH4+量来衡量。b-葡萄糖苷酶(b-Glucosidase)的测定：参考文献：1. Tabatabai M.A., 1982. Soil enzymes. In Methods of Soil Analysis, Part 2. Chemical and Microbiological Properties- Agronomy Monograph No. ( second Edition), pp 903-9472. Hopkins D.W., Sparrow A.D., Shillam, L.L., English, L.C., Dennis, P.G., Novis, P., et al., 2008. Enzymatic activities and microbial communities in an Antarctic dry valley soil: Responses to C and N supplementation. SBB. Doi:10.1016/j.soilbio.2008.03.022称取相当于烘干基1g 新鲜土壤样品置于30ml试管（或50ml的容量瓶）中，加入4ml pH6.5的缓冲液和1ml 0.025 M的对硝基苯基-b-D-葡萄糖苷（p-nitrophonyl-b-D-glucopyranoside，充分混合后塞上瓶塞在37度下培养1小时，然后加入1 ml 0.5 M CaCl2和4ml pH为12的0.1M tris-NaOH缓冲液，摇动悬液几秒钟。悬浊液立刻通过Whatman 2滤纸过滤。最后在400nm测定（黄色溶液的）吸光值。(SBB2008, Trasar-Cepeda; SBB2008, Hopkins; Geoderma2005, Caravaca et al.)重复两次。每个土样做相应的对照1个，并做无土对照两个。如果土样测定值超出标准曲线的范围，可进行适当的稀释。标准曲线的制作：将10 ml 标准对硝基酚标准溶液稀释到100ml的容量瓶中，充分混合均匀(此溶液的浓度为100mg/L)。然后吸取此稀释后的标准溶液0，1，2，3，4和5ml分别在50 ml的容量瓶中，加水至5 0ml (浓度分别为0、2、4、6、8和10 mg/L)。吸取此系列标准溶液各5ml于容器中，然后，在与土壤酶提取液同样条件下在400 nm下测吸光度。（即在每个色阶溶液中分别加入1 ml 0.5 M CaCl2和4ml pH为12的0.1M tris-NaOH缓冲液，然后过滤，最后测定吸光值）。此标准曲线应现配现测。试剂配制：1. pH6.5的缓冲液 保存液的配制：三羟甲基氨基甲烷Tris(hydroxymethyl)aminomethane (THAM) 12.1g；顺式丁烯二酸 (Maleic acid) 11.6g；柠檬酸(citric acid) 14.0g；硼酸(boric acid, H3BO3, 无结晶水) 6.3g于488 ml 1N NaOH溶液中，加水定容至1000 ml，保存于冰箱中。200 ml 储存液中置于500 ml的烧杯中（放置一个磁性搅拌棒，烧杯放置在一个磁力搅拌器上）。用0.1N盐酸滴定至pH6.5 (约需盐酸溶液400ml)，最后添加蒸馏水（约400ml）至1000ml。2. 0.5 M CaCl2溶液 溶解73.5g CaCl2.2H2O于水中，定容之1L。3. 0.1M tris-NaOH（pH为12）缓冲液 溶解12.2g 三羟甲基氨基甲烷液Tris(hydroxymethyl)aminomethane (THAM)于800 ml 的水中，滴加0.5M的NaOH溶液调节pH至12，最后定容至1L。4. 0.025 M的对硝基苯基-b-D-葡萄糖苷基质溶液 溶解0.377g 对硝基苯基-b-D-葡萄糖苷（p-nitrophonyl-b-D-glucosidase, PNG）于50ml的pH 6.5的缓冲液中（定容）。(此溶液在冰箱中可以稳定几天时间)。5. 标准对硝基苯（p-Nitrophenol）溶液：溶解1.0g对硝基酚于70ml水中，然后用水稀释至1升。此溶液应保存于冰箱中。酸性和碱性磷酸酯酶活性的测定称取相当于烘干基1g的 新鲜土壤样品置于30ml试管或者容量瓶中（Erlenmeyer），加入4ml pH 6.5（酸性磷酸酯酶）或11（碱性磷酸酯酶）的缓冲液和1ml 0.025 M的对硝基苯基磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate，PNP）基质溶液，塞上瓶口后充分混合后在37度下培养1小时，然后加入1 ml 0.5 M CaCl2和4ml 0.5M NaOH溶液，摇动几秒钟。悬浊液立刻通过Whatman 2滤纸过滤。最后在400nm测定吸光值。标准曲线的制作：将10 ml 标准对硝基酚标准溶液稀释到100ml的容量瓶中，充分混合均匀(此溶液的浓度为100mg/L)。然后吸取此稀释后的标准溶液0，1，2，3，4和5ml分别在50 ml的容量瓶中，加水至5 0ml (浓度分别为0、2、4、6、8和10 mg/L)。吸取此系列标准溶液各5ml于容器中，然后，在与土壤酶提取液同样条件下在400 nm下测吸光度。（即在每个色阶溶液中分别加入1 ml 0.5 M CaCl2和4ml 0.5M NaOH溶液，摇匀后过滤，最后测定吸光值）。对照：必须对每一个样品做对照实验，以对非来自于磷酸酯酶水解产生的对硝基苯的黄色进行减除。对照与酶试验的步骤完全相同，只是1ml 的PNP溶液在滴加1 ml 0.5 M CaCl2和4ml 0.5M NaOH溶液后，亦即过滤之前立即加入。1、pH6.5的缓冲液 同前葡萄糖苷酶活性的测定。pH 11的缓冲液的配置：200 ml 储存液中置于500 ml的烧杯中（放置一个磁性搅拌棒，烧杯放置在一个磁力搅拌器上）。用0.1N氢氧化钠溶液滴定至pH 11，最后添加蒸馏水（约400ml）至1000ml。2、0.5 M CaCl2溶液 溶解73.5g CaCl2.2H2O于水中，定容之1L。3、0.5M的NaOH溶液 溶解20g NaOH于水中，定容之1L。4、0.025M对硝基苯磷酸盐（p-Nitrophenyl phosphate）溶液 溶解0.420g (称量应根据实际买到的试剂的结晶水不同有变化)对硝基苯磷酸盐四水合物于40ml 的 pH 6.5（酸性磷酸酶）或pH 11（碱性磷酸酶）的缓冲液中，用同样的溶液最后定容至50ml。5、标准对硝基酚溶液。同前。脲酶活性的测定：称取相当于烘干基5g新鲜土样置于一个50ml的容量瓶中，加入0.2ml的甲苯（Toluene）和9ml的THAM缓冲液，摇动容量瓶几秒钟，使其混合。然后加入1ml 0.2M的尿素溶液，再次摇动容量瓶几秒钟。塞上瓶塞，在37度下恒温培养2小时后(对照培养期间不加1ml 0.2M)，除去瓶塞，加入35ml KCl-Ag2SO4溶液，摇动几秒钟，然后静置使瓶温降低至室温（5分钟）。然后用KCl-Ag2SO4溶液定容至50ml。吸取20ml(10ml)悬液在定氮装置中，加入0.2g MgO蒸馏4分钟。用10ml硼酸指示剂溶液吸收馏出液，当馏出液体积达到50ml(40ml)左右后，用标准H2SO4溶液滴定至终点。进行空白试验以校正非来自于尿素水解产生的铵离子。空白与试样的实验完全相同，只是在培养结束后加入35ml KCl-Ag2SO4溶液后再加入0.2M的尿素溶液1ml。试剂配置：1. 甲苯。2. 0.05M tris（pH为9.0）缓冲液： 溶解6.1gTHAM于700ml水中，用0.2M H2SO4滴定pH至9.0，然后定容至1L。3. 0.2 M 尿素溶液： 溶解1.2 g尿素于80ml 0.05M tris缓冲液中，然后用该缓冲液定容至100ml。保存于冰箱中。4. KCl (2.5M)-Ag2SO4(100ppm)溶液：溶解100mg Ag2SO4于700ml水中，然后再溶解188g KCl于该溶液中，最后定容至1L。5. 定氮的试剂：MgO，硼酸指示剂混合液，0.005 N （0.0025M）H2SO4溶液。6. 指示