骨髓间充质干细胞对大鼠重症急性胰腺炎损伤修复的作用.doc

【摘要】目的 探讨骨髓间充质干细胞（MSC）对重症急性胰腺炎（SAP）胰腺损伤的修复作用。方法 将60只大鼠随机（随机数字法）分为健康对照组、SAP模型组、MSC移植组、MSC加粒细胞集落刺激因子（G-CSF）联合组。免疫荧光检测MSC的转化率，生化法检测血清淀粉酶含量，ELISA法检测血清白介素IL-6质量浓度。结果 骨髓间充质干细胞转化率上升，血清淀粉酶含量和白介素IL-6质量浓度下降，增加粒细胞集落刺激因子（G-CSF）联合治疗，MSC细胞量较少时，产生协同作用增强MSC的修复作用，MSC细胞量较大时，产生拮抗作用加重胰腺组织的损伤。差异有统计学意义（P中国论文网 【关键词】骨髓间充质干细胞；重症急性胰腺炎；保护作用；粒细胞集落刺激因子 Explore the protective effects of the bone marrow mesenchymal stem cells on severe acute pancreatitis in ratsSHAN YU-qiang*，LUO Liang，JIA Zhong，CAI Yang，JIN Hui-cheng，FENG Guang-hua. *Department of Genernal Surgery， Hangzhou First Peoples Hospital， Hangzhou 310006，China Correspondance author：JIN Hui-cheng， Email： 【Abstract】Objective To investigate effects of bone marrow mesenchymal stem cells （MSC） on severe acute pancreatitis（SAP）in rats.Methods A total of 60 rats were randomly divided into normal group （n = 10）， the model of SAP group （n = 10）， the transplantation of the MSC group （n =20）， the combination of the MSC and the granulocyte colony-stimulating factor （G-CSF） group （n = 20）. The conversion rate of MSC was detected by using immunofluorescence methods， and the level of amylase in serum was assayed by using biochemical methods.Simultaneously， the level of interleukin-6 （IL-6） in serum was determined by using enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The conversion rates of the MSC increased， and consequently， the levels of amylases and interleukin-6 in serum were reduced（P1。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是存在于多种器官中的多能干细胞，具有多向分化潜能，且易进行体外分离和纯化培养。因此，探索其在胰腺损伤中发挥的修复作用，具有重要的临床应用价值2-3。粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）是一种多肽链的细胞生长因子，具有免疫调节、血管保护及促进血管发生的作用。近年来，使用MSC缓解脊髓损伤、MSC治疗脑损伤、MSC治愈肺损伤等具有一定作用3-4。因此，本实验首次以SAP大鼠模型为研究对象，尾静脉注射EDU标记的MSC与G-CSF，检测SAP大鼠胰腺组织的免疫荧光及转化率、血清淀粉酶的含量和白介素IL-6的质量浓度。探讨MSC对SAP胰腺损伤后修复作用的机制5，为临床开展MSC治疗重症急性胰腺炎提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物与主要试剂 雌性成年大鼠，鼠龄8周，60只，体质量200250 g，由南方医科大学实验动物中心提供，动物合格证：0096502；雌性幼鼠，鼠龄4周，5只，体质量4050 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证：0097319； L-精氨酸购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；重组人粒细胞刺激因子注射液购于齐鲁制药有限公司；淀粉酶检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；IL-6 ELISA试剂盒购于Neo Bioscience公司。 1.2 方法 1.2.1 MSC的分离培养及EDU标记 造模前1周，将雌性幼鼠脱臼处死，用75%酒精浸泡。无菌条件下分离股骨和肱骨，用DMEM培养基冲出骨髓，制备成单细胞悬液。取3代以后的MSC调整细胞质量浓度分别为1106个/ml和5106个/ml备用。将全部细胞进行EDU标记，使用4%多聚甲醛固定后，在0.5%Trion X-100的PBS中室温孵育，再加入1Apollo工作液避光进行孵育，DAPI染核后荧光淬灭剂封片，荧光显微镜拍照。 1.2.2 动物分组及造模 将60只雌性成年大鼠，随机（随机数字法）分为6组，每组10只。健康对照组，不作任何处理。SAP模型组，通过2次腹腔注射间隔1 h，注射L-精氨酸2 g/kg制作SAP模型，造模后12 h经尾静脉注射PBS。少量MSC移植组，造模后12 h经尾静脉注射1106个/ml分离培养的MSC。大量MSC移植组，造模后12 h经尾静脉注射5106个/ml分离培养的MSC。少量MSC加G-CSF联合组，造模后12 h经尾静脉注射1106个/ml分离培养的MSC后，并于12、24、36 h时点经尾静脉注射40 g/kg的G-CSF。大量MSC加G-CSF联合组，造模后12 h经尾静脉注射5106个/ml分离培养的MSC后，并于12 h、24 h、36 h经尾静脉注射40 g/kg的G-CSF。分组注射成功后，分别在第3天、第7天随机处死每组5只大鼠，解剖取胰腺组织并取血。免疫荧光检测胰腺组织及MSC的干细胞转化率，生化法检测血清淀粉酶的含量，ELISA法检测白介素IL-6的质量浓度。 1.2.3 检测免疫荧光及转化率 分别在第3天、第7天处死每组5只大鼠解剖取胰腺组织。将胰腺组织置于4%中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片、染色，观察胰腺组织病理学变化。二甲苯脱蜡，依次经过100%、95%、85%、75%、50%乙醇、纯水，再进行抗原修复，10%正常山羊血清封闭，一抗4孵育过夜。荧光标记二抗室温湿盒避光孵育，再使用DAPI室温湿盒避光孵育，抗荧光淬灭剂封片后使用荧光显微镜观察。免疫荧光技术检测CK19，分析MSC分化的干细胞转化率。 1.2.4 生化法检测血清淀粉酶含量 分别在第3天、第7天每组5只大鼠尾静脉取血，全血离心并分离血清，用于血清淀粉酶含量的检测。 1.2.5 ELISA法检测血清白介素IL-6质量浓度 空白孔加入标准品通用标本稀释液，反应孔加入标本和不同质量浓度的标准品。再在空白孔加入生物素化抗体稀释液，反应孔加入生物素化抗体工作液。避光室温放置后，空白孔加入酶结合物稀释液，反应孔加入酶结合物工作液。使用酶标仪检测白介素IL-6的OD450值，并根据标准曲线的公式计算白介素IL-6的质量浓度。 1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件完成统计处理，实验数据以均数标准差（xs）表示。组间比较采用多重样本独立非参数检验和重复测量方差分析，以P0.05）。见表1、图2。 2.4 血清淀粉酶含量的检测 健康对照组淀粉酶含量低于SAP模型组，MSC移植组淀粉酶含量也低于SAP模型组。少量MSC移植组淀粉酶含量高于大量MSC移植组，少量MSC加G-CSF联合组淀粉酶含量在各组别中最低，大量MSC加G-CSF联合组淀粉酶含量在各组别中最高，组间差异具有统计学意义（P0.05）。见表2。 2.5 血清白介素IL-6质量浓度的检测 健康对照组IL-6质量浓度低于SAP模型组，MSC移植组IL-6质量浓度也低于SAP模型组。少量MSC移植组IL-6质量浓度高于大量MSC移植组，少量MSC加G-CSF联合组IL-6质量浓度在各组中最低，大量MSC加G-CSF联合组IL-6质量浓度在各组中最高，差异具有统计学意义（P0.05）。见表3、4，图3。 3 讨论 在重症急性胰腺炎（SAP）的临床发展过程中，没有进行治疗的重症急性胰腺炎，第3天是SAP的急性炎症期，表现为最危急的胰腺炎症状6-7。重症急性胰腺炎经过有效治疗后，第7天是SAP的炎症缓解期，临床表现为症状有所缓解，各项检测指标也会有相应程度的改变8。 实验结果可知，骨髓间充质干细胞（MSC）9的转化率上升，血清淀粉酶的含量和白介素IL-6的质量浓度下降。免疫荧光检测的双荧光表明，在SAP导致胰腺损伤时，骨髓间充质干细胞分化为胰腺干细胞，修复并再生胰腺组织10。在胰腺组织得到修复并且SAP的炎症逐渐缓解后，直接引起体内淀粉酶含量下降，同时，炎性介质白介素IL-611的含量也随之下降。因此，本实验结果验证了SAP由急性炎症状态到炎症缓解状态的指标改变以及修复过程。 通过组合疗法的实验结果可知，骨髓间充质干细胞对SAP造成的胰腺损伤，有明显的修复作用。并随着MCS的细胞量增多，干细胞的转化率升高，炎性症状减轻，炎性介质减少，骨髓间充质干细胞的修复作用增强。增加粒细胞集落刺激因子（G-CSF）12，产生一定的刺激及免疫调节作用。当MSC细胞量较少时，G-CSF的刺激作用表现出协同效应，进一步加大MSC的干细胞转化率，抑制炎性症状，降低炎性介质，联合增强骨髓间充质干细胞的修复作用13。但当MSC细胞量较大时，G-CSF的刺激作用表现出拮抗效应，干细胞转化率受到严重干扰，炎性症状加重，炎性介质增多，拮抗作用极大地加重胰腺组织的损伤。大量研究表明，主要是由于重症急性胰腺炎损伤胰腺组织后，加入的骨髓间充质干细胞转化为胰腺干细胞，进行再生和自我修复，改善胰腺组织的功能。同时由于不同的协同作用及拮抗作用，粒细胞集落刺激因子的免疫调节作用可以向两个相反的方向发挥功效。骨髓间充质干细胞有着极高的临床应用价值14。 本实验分析MSC在胰腺损伤后发挥修复作用的机制，在加入骨髓间充质干细胞进行SAP治疗时，重症急性胰腺炎导致胰腺组织损伤后，释放炎性因子的同时，产生干细胞迁移因子，引导骨髓间充质干细胞进行定向迁徙至胰腺，并分化为胰腺干细胞，从而促进组织再生，发挥修复胰腺的作用。此时，也可分泌干细胞特异性生长因子，增强胰腺组织再生作用，改善SAP导致的胰腺组织损伤。加入粒细胞集落刺激因子后，根据不同MSC的细胞量，导致不同的协同或拮抗效应关系。MSC联合G-CSF发挥协同免疫调节作用时，抑制胰腺星状细胞的活化，降低炎症因子的损伤，减轻胰腺的免疫炎性反应。MSC联合G-CSF发挥拮抗免疫调节作用时，激活NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞，从而导致加重胰腺的组织损伤15-16。 参考文献 1王自法， 潘承恩， 刘绍诰. 重症急性胰腺炎发病机理研究进展J. 中华普通外科杂志， 1999， 14（2）： 144-146. 2 施亚斌， 李香业， 陆岳林，等. 肿瘤化疗前应用重组人粒细胞集落刺激因子预防白细胞减少临床研究J. 医学研究杂志， 2007， 36（1）： 55-57. 3 高婧， 蔡曦光， 刘华. 骨髓间充质干细胞移植对百草枯所致急性肺损伤治疗的研究J. 国际呼吸杂志， 2011， 31（3）： 270-274. 4 江学良， 李兆申， 崔慧斐. 骨髓间充质干细胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用J. 世界华人消化杂志， 2006， 14（4）： 398-404. 5 张敏， 杨慧. 骨髓基质细胞在细胞移植与基因治疗中的应用J. 中国生物工程杂志， 2003， 23（1）： 9-14. 6 刘建辉，李全福，刘爱梅，等.早期腹腔镜手术联合内镜鼻胆（胰）引流治疗重症急性胰腺炎的临床研究J/CD. 中华危重症医学杂志：电子版，2008，1（2）：115-117. 7李兆. 急性胰腺炎的内科治疗J. 中国实用内科杂志， 2004， 24（8）： 710-713. 8 张圣道， 雷若庆. 当今重症急性胰腺炎治疗中的几个问题J. 中国实用外科杂志， 2003， 23（8）： 515-516. 9李佳慧，张楠，乔薇，等. 缺氧骨髓干细胞对糖尿病心肌病的保护作用J. 中华急诊医学杂志， 2011， 20（11）： 1062-1066. 10 郭军一， 林国生， 鲍翠玉. 干细胞因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与分化