五味子合剂对糖尿病肾病小鼠肾组织MCP-1及iNOS表达的影响.doc

五味子合剂对糖尿病肾病小鼠肾组织MCP-1及iNOS表达的影响 赵君 张勉之 谭小月摘要 目的：观察五味子合剂(SM)对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病(DN)小鼠肾组织MCP-1及iNOS表达水平的影响。方法：雄性C57BL/6 小鼠24 只随机分正常对照组、DN模型组和SM治疗组，采用腹腔注射STZ 法建立DN模型，收集各组血、尿及肾组织，检测血糖、体质量及尿白蛋白肌酐比值(UACR)，光镜观察肾组织形态改变；免疫组化法检测各组肾组织MCP-1及iNOS的表达；RT-PCR检测各组肾组织单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA水平。结果：与模型组比较，SM治疗组血糖及UACR降低；小球系膜区、小管间质区细胞外基质堆积减少。SM能下调肾组织中MCP-1及iNOS的蛋白和mRNA表达水平(P0.05)。结论：SRC可以通过下调MCP-1及iNOS的表达以减轻肾组织内的炎症反应，从而减轻DN小鼠的肾脏损伤。关键词 五味子科 糖尿病肾病 单核细胞趋化蛋白-1 诱导型一氧化氮合酶 小鼠 近交C57BL Effect of Schisandra Chinensis Mixture on Expression of MCP-1 and iNOS in Renal Tissues of Mice withDiabetic Nephropathy ZHAO Jun,TAN Xiaoyue,ZHANG Mianzhi Tianjin Medical University,Tianjin300070,ChinaAbstract Objective:To investigate the effect of schisandra chinensis on the expression of MCP-1 and iNOS in renal tissue of mice with Diabetic Nephropathy induced by streptozotocin(STZ). Methods:Twenty-four male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups:normal control group,diabetic model group and SM-treated group.The mouse model of diabetes was induced by STZ intraperitoneally.The serum level of glucose,body weight and urinary albumin creatinine ratio(UACR) were measured. Furthermore,the morphological changes of renal tissue were observed under microscope.The expression of mRNA in kidney tissues were determined by RT-PCRl method.The protein expression in kidney tissues were determined by immunohistochemical method. Results:Compared with the diabetic model group,there were significantly lower level of serum glucose and UACR in SM-treated group,SM could also reduce the extracellular matrin accumulation in glomerular mesangial region and renal tubule and interstitial area. There were lower protein and mRNA expression of MCP-1 and iNOS in SM group.,too(P0.05).Conclusion:After treatment of SM, the expression of MCP-1 and iNOS were decreased, which may reduce renal inflammation and relieve renal injury.Key words schisandraceae diabetic nephropathies MCP-1 iNOS mice C57BL糖尿病肾病(diabetic nephropathy ,DN)是世界范围内终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的最主要原因之一。中华医学会糖尿病分会慢性并发症调查组对全国30个省、市、自治区，1991年到2000年在内分泌科住院的24496例糖尿病患者的临床和实验检查资料进行统计及回顾性分析，结果显示糖尿病肾脏并发症的患病率是33.6%1。DN是多因素组合作用引起的疾病，涉及高血糖、多元醇-肌醇代谢异常、肾小球血液动力学改变、蛋白质的非酶糖基化及血管生长因子表达异常等，最近的基础和临床研究表明，炎症因子与DN的发生密切相关，并认为DN是一种炎症性疾病2。本实验拟通过构建链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的小鼠DN模型以探讨SM对炎症因子MCP-1及iNOS表达的影响。1 材料与方法1.1 实验动物与分组 雄性C57BL/6小鼠316只，6-7周龄，体重20-25g，购自南开大学生命科学院实验动物中心。随机分为正常对照组（对照组，5只）、DN模型组(模型组，10只)、SM治疗组(治疗组，9只)共三组。1.2 试剂、药物与材料 STZ为美国sigma公司出品, 用0.1mol/l ph4.5灭菌枸橼酸-枸橼酸钠溶液中配置成浓度为12.5mg/ml的溶液；SM由五味子、川芎、牡蛎组成， 90乙醇加热回流3 h，提取2 次，合并提取液，静置过滤, 减压回收乙醇浓缩成浸膏，-20保存3。免疫组化封闭液、抗体购自美国Santa Cruz公司，DAB显色试剂盒购自北京中彬生物工程有限公司。总RNA提取试剂盒和M-MLV逆转录酶购自Takara公司， PCR扩增仪、台式高速离心机及凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司。引物由生工生物有限公司合成，其中，MCP-1上游引物为5-GGTGTCCCAAAGAAGCTGAG-3，下游引物为5-TCTCTGTCATACTGGTCACTTC-3，大小为153bp；iNOS上游引物为5-GTCGTCCGCTTTGCCACGGA-3,下游引物为5-TGCGACAGCAGGAAGGCAGC-3,大小为162bp；GAPDH上游引物为5-AAGAACAGGCTCTTAGCA-3,下游引物为5-CCAGTAGACTCCACGACAT-3,大小为134bp。1.3 动物模型构建 小鼠自由供给水及食物，适应性喂养1 周后, 禁食15h。模型组及治疗组均给予STZ125mg/kg腹腔注射,对照组予等体积枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液；24小时候等量重复注射；1周后测晨起血糖，若血糖值16.7mmol/l则纳入实验4。治疗组予SM0.3ml/d相当五味子生药量5g/(Kg.d)灌胃，模型组、对照组予等体积自来水灌胃。每天16:00给药1 次，连续给药7周。因死亡原因剔除部分小鼠，至实验结束时，模型组与治疗组均剩余6只。1.4 标本收集及处理 实验结束前用天平称体质量，经剪尾取血后用血糖仪测定各组小鼠血糖值(BS);随机收集小鼠尿液，用高效液相色谱法测定尿白蛋白及尿肌酐浓度，并计算UARC=尿白蛋白浓度（g/ml）尿量（ml）/尿肌酐浓度尿量（ml）。采用水合氯醛麻醉小鼠，摘取左肾，切取部分于中性福尔马林中固定24h后脱水、包埋、切片（3m）,部分立即置于液氮中，后置于-80冰箱保存供RT-PCR检测用。1.5 肾组织形态学观察 3m石蜡切片常规脱蜡至水，行Gomori 六胺银（PASM）染色，光镜下观察肾组织形态学改变。1.6 单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达 采用免疫组化法检测。3m石蜡切片常规脱蜡至水，新鲜配制的3过氧化氢室温避光孵育10 min以消除内源性过氧化物酶；微波抗原修复20 min，牛血清白蛋白室温封闭1小时，依次加I抗（小鼠MCP-1、iNOS多克隆抗体，湿盒内4过夜)，生物素标记抗工作液及辣根酶标记的链霉素卵白素工作液，室温下DAB显色，苏木素轻度复染，脱水、透明后用中性树胶封片。光镜下观察MCP-1及iNOS的表达。1.7 MCP-1及iNOS的mRNA表达 采用RT-PCR检测。采用Trizol试剂盒从小鼠肾脏中提取总mRNA,紫外分光广度仪检测mRNA的含量与纯度，采用逆转录试剂盒将其逆转录成cDNA，然后在琼脂凝胶中电泳，凝胶成像系统成像后以GAPDH为内参，用ImageJ数码图像分析软件进行分析，以扩增片段与GAPDH的灰度比值表示产物多少，进行半定量。逆转录条件：两步反转法：7010分钟，冰上2分钟；加入Rnase及M-MLV后421小时，7010分钟，置于冰上。PCR条件：94变性30秒，60退火30秒，72延伸1分钟。1.8 统计学方法 用SPSS 120统计软件处理，数据用均数标准差（s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 生化指标 模型组与治疗组较对照组血糖明显升高，差异有统计学意义(P0.01),治疗组与模型组差异无统计学意义；模型组与治疗组体质量均低于对照组，差异有统计学意义(P0.01),治疗组与模型组差异无统计学意义；模型组与治疗组UARC均高于对照组，差异有统计学意义(P0.01),但治疗组低于模型组，差异有统计学意义(P0.05),见表1。表1 各组BS、体质量和ACR比较 (s)组别n BS(mmol/L)体质量(g)ACR(g/g)对照组(1)5 6.070.40 26.970.84 1.8130.325 模型组(2)6 26.553.65 17.561.27 11.5810.616 治疗组(3)6 26.086.68 19.352.70 1.1200.073 F 20.548* 23.446* 523.379* P(1):(2) 0.001 0.001 0.001P(1):(3) 0.001 0.002 0.001P(2):(3) 0.899 0.266 0.001*P0.012.2 肾组织形态学变化 PASM染色可见DN模型组较正常对照组基底膜明显增厚，系膜区扩张、系膜基质增加(黑色)，肾毛细血管球面积增大，治疗组较模型组纤维化的程度显著减轻，见图1.2.3 免疫组化结果 正常对照组肾小球周围、肾小管上皮细胞及肾间质几乎未见MCP-1及iNOS阳性表达，DN模型组上述部位MCP-1及iNOS则为强阳性表达(棕黄色颗粒）,治疗组较模型组MCP-1及iNOS阳性表达明显减轻，见图2。2.4 RT-PCR结果 模型组MCP-1及iNOSmRNA表达水平均高于对照组和治疗组，差异有统计学意义(P0.05),经治疗后MCP-1及iNOS表达下降，较模型组差异有统计学意义(P0.05)，见图3,表2。 1、2为对照组，3、4为模型组；5、6为SM治疗组图3:三组MCP-1及iNOSmRNA表达的变化表2 各组MCP-1、iNOS与GAPDH的PCR条带光密度比值比较组别n MCP-1/GAPDHiNOS/GAPDH对照组(1) 51.6170.0371.1520.347 模型组(2) 60.6710.0440.4450.075 治疗组(3) 61.5090.0280.9590.086 F6.446*9.082* P(1):(2)0.0160.006P(1):(3)0.7240.302P(2):(3)0.0450.024*P0.05 3 讨论 DN是糖尿病严重的微血管并发症之一，其主要病理表现是肾小球肥大、肾小球系膜区细胞外基质增多，部分肾小球结节性或弥漫性硬化伴肾小管间质纤维化。既往对DN的发病机制研究多集中在高血糖、脂质代谢紊乱、遗传基因易感性等方面，近年来研究表明炎症反应在糖尿病肾病发生发展中起到重要作用，Katherine提出应把糖尿病肾病看作是一种代谢紊乱引起的炎性疾病5；2006年Hotmamisligil在Nature发表文章首次提出代谢性炎症的概念，指出此炎症不同于传统的以红肿热痛为特点的炎症，而是一种慢性低度、代谢引发的炎症，其分子机制和信号通路类似于传统的炎症反应6。这些新认识填补了炎症在糖尿病肾病发病机制的理论空白，为治疗DN提供了新方向。本实验初步探索了STZ诱导的DN小鼠模型中炎症因子MCP-1及iNOS表达的变化及SM对此的影响。 MCP-1是趋化因子C-C亚家族的一员，它是最为公认的单核细胞趋化因子，对单核巨噬细胞有很强的趋化激活作用。型或型DN患者肾组织活检及DN大鼠肾脏病理学检查均证实MCP-1是单核巨噬细胞聚集激活的主要因素7。巨噬细胞在肾小球和小管间质的广泛浸润是肾脏疾病的重要特征之一，其浸润程度可以预示肾脏损害的进展8 。MCP-1可由单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肾小球系膜细胞等分泌，在生理情况下呈低水平表达，DN时在高血糖、血管紧张素、氧化应激、肾小球血流动力学改变等刺激因素的影响下表达明显上调9。研究表明，持续的蛋白尿和肾脏纤维化与MO/M的浸润和MCP-1的高表达有关10。MCP-1可诱导血液中的MO/M向肾脏局部聚集、活化，活化的MO/M通过产生诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧基团(ROS)、活性金属蛋白酶，促进NO的合成，产生细胞毒作用，导致肾小球损伤；并能分泌细胞因子如白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)损伤肾小球基底膜，促使系膜细胞合成纤维黏连蛋白(PN)、层黏连蛋白(LN)，参与肾小球硬化的发生、发展11。此外，MCP-1还能直接造成肾脏损伤，它通过释放溶酶体酶及超氧化物阴离子，诱导IV型胶原的合成，造成肾小球系膜区细胞外基质堆积；还可以诱导休眠状态下的纤维细胞转化为成纤维细胞，促进肾小管间质纤维化12。本实验结果表明MCP-1在对照组表达较少，模型组表达显著升高，经SM治疗后其表达下降，说明SM通过下调MCP-1的表达水平，发挥阻抑巨噬细胞在肾小球系膜区及小管间质的聚集和活化的作用，减少蛋白尿，减轻DN炎症反应，进而阻止或延缓肾脏纤维化。 一氧化氮(NO)是细胞内和细胞间重要的的信号调节分子，生理状态下由构成型一氧化氮合酶(cNOS)催化合成,对肾功能有重要影响，如调节肾脏及肾小球血流动力学、肾素分泌、球管反馈效应及排钠等。诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)是一氧化氮(NO)合成限速酶家族中的诱导亚型，并被认为是M1型巨噬细胞的标志，M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子在炎症中发挥重要作用13。随着DN的进程，巨噬细胞等受到细胞因子刺激活化释放iNOS，引起NO长期大量释放，在局部炎症和免疫反应中起细胞毒和细胞抑制作用，过量的NO可通过介导肾小球高滤过，促进系膜细增与细胞外基质增生，并且持续性微量白蛋白尿的产生也与NO大量长期合成有关。经SM治疗后DN小鼠iNOS的表达明显下调，表明该药可通过抑制iNOS的表达以减少NO的大量生成，进而改善肾小球高滤过、高压力的状态以减少蛋白尿产生，减少细胞外基质沉积以延缓肾脏纤维化。 综上所述，SM可通过抑制糖尿病肾病小鼠MCP-1及iNOS的表达以减轻DN炎症反应，从而改善蛋白尿、减少肾小球系膜区和肾小管间质细胞外基质增生，阻止和延缓糖尿病肾病的进展。参考文献1 中华医学会糖尿病分会慢性并发症调查组.19912000年全国住院糖尿病患者慢性并发症及相关大血管病变回顾性分析J .中国医学科学院学报，2002,24(5):447-451.2 Mora C，Navano JF.The role of inflammation as a pathogenic factor in the development of renal disease in diabetesJ.Curr Diab Rep,2005,5(3):399-401.3Huang F,Xu L,Gaogang S,et al.Antioxidant isolated from schisandra propinqua(Wall)BaillJ.Bioc Res,2009,42(3):351-356.4刘苗，张勉之，谭小月等.复方五味子醇提液对糖尿病肾病的治疗作用及机制J.天津医药，2011,39(6):557-559.5 Katherine R Tuttle .Linking Metabolism and Immunology:Diabetic Nephropathy is an 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