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噬菌体表面展示技术的研究进展病毒学论 文题 目：噬菌体表面展示技术的研究进展学生姓名：刘小燕学 号：08102041033系（院）：英东生命科学学院专 业：生物技术班 级：08生物技术（1）班指导教师姓名及职称：黄晓敏教授 起止时间： 2011 年 3 月 2011 年 4 月（教务处制表）噬菌体表面展示技术的研究进展刘小燕 （英东生命科学学院 08生物技术 08102041021）摘要：噬菌体表面展示技术是将各种多肽或蛋白质，以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使蛋白质的功能与其基因密码有机的连接在一起的技术。它是一种简便、有效、易于控制的用于肽库表达的操作系统,在诸多研究领域都展示了其独特的优势，具有极广阔的发展前景。本文概述了噬菌体表面展示技术的原理、应用现状和研究进展等主要内容。关键词：噬菌体遗传密码肽库应用噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，作为病毒的一种，噬菌体具有病毒特有的一些特性：个体微小；不具有完整细胞结构；只含有单一核酸。80年代中期，Georgep.s在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。目前,噬菌体展示技术的研究进展很迅速，在开发新型疫苗、抗体工程、DNA 结合蛋白研究等生物技术研究的不同领域得到了很大的应用，受到越来越多人的关注。1 噬菌体的表面展示技术的基本原理及特点噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。其中基本技术原理是：将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。1 2该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。到目前为止，人们已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。22 噬菌体的表面展示技术的应用现状21,开发新型疫苗由噬菌体介导的DNA疫苗的出现，克服了核酸疫苗进入体内后大部分被细胞降解和清除的缺陷问题，而且噬菌体不但具有生产工艺简单、制备快速容易、自然条件下储存比较稳定(4C稳定保存至少6个月)、在宿主的真核组织中不能复制、避免了抗生素携带和可通过口服途径呈递抗原等优点，还能够容纳较大的外源片段(长达23Kb)和多个疫苗基因，因此这类疫苗将成为以后几年内研究的热点。2 422，在疾病发生机理和治疗中的应用噬菌体治疗是利用噬菌体溶解细胞的作用而用于治疗人和动物的病原细菌的临床感染.早在20世纪初,噬菌体治疗就取得过积极的治疗效果.针对传统抗生素治疗动物细菌感染时易产生残留及细菌耐药性等缺点,噬菌体治疗更表现出许多突出的优越性.目前，在疾病的治疗和致病机理方面的研究多应用噬菌体展示技术进行体内筛选，Lee L将人滑膜和皮肤移植到裸鼠体内，进行肽库体内筛选，得到了与人滑液微血管内皮特异结合而与皮肤和鼠的微血管内皮不结合的小肽，为直接筛选与人组织器官有特异结合活性的分子提供了一条新途径，也为靶向治疗关节炎提供了一个新思路。噬菌体展示技术还可应用于疾病发生机理的研究。Weetman 等报道应用噬菌体展示技术可以鉴别甲状腺炎发病过程中自身抗体的变异,并且可以绘制出自身抗原表位的空间构象图。4 523，DNA 结合蛋白研究锌指蛋白是一类DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同DNA 序列的锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。24, 蛋白质组学的研究噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。825,模拟表位的筛选噬菌体展示技术最直接的用途是筛选模拟表位。用此项技术可鉴别体内信号分子配体的模拟表位,既可竞争性的抑制自然配体,又可构画出表位的空间图象,最近此技术还被用于细胞间信号传导、酶特异性、生长激素等的研究。JunjianX 用能中和天然活性碱性纤维原细胞生长因子(bFGF) 的单克隆抗体GF22 从噬菌体展示肽库中筛选出bFGF模拟表位,研究发现噬菌体展示模拟表位比天然表位诱发的抗体活性高3 倍,这表明此模拟表位噬菌体可以作为肿瘤疫苗用于预防和治疗肿瘤。26,信息传递研究利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个Hantaviral受体；受体的配体，如血管促生素、-bungarotoxin；一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3 和WW 区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽。因此在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。27, 在抗体工程中的应用利用噬菌体的表面展示技术可筛选到亲和力和特异性都令人满意的并且修饰过的抗体,随着此项技术的发展, 噬菌体抗体库技术将为未来10 年的药物研制和靶分子确定提供研究工具和发展平台。一般来说，噬菌体抗体库有三种类型，即天然抗体库、合成抗体库和免疫抗体库。噬菌体抗体库技术发展至今,已可在两周内根据各种靶分子筛选出相应的具有高亲和力的抗体。它在考虑到抗体分子的大小、价数、亲和力及效应区功能的同时简化了抗体生产程序。除此之外, 抗体片断还可通过某些方法如形成二聚体或多聚体分子来增加结合部位,以达到增加抗体的亲和力或价数的目的。1988 年,Cruz 把疟原虫的环孢蛋白基因克隆进丝状噬菌体后在噬菌体表面展示了重组蛋白,并用重组噬菌体免疫兔子证实了展示肽的抗原性和免疫原性。3 93 技术的研究进展20世纪70年代的发展，噬菌体使得人们可以系统的探测到基因序列，随后在80年代，产生了蛋白质工程。贯穿20世纪80年代，大部分蛋白质工程的科学家一次可以产生与纯化一个蛋白质突变体，并且鉴定其功能特性。一些研究者开发出一些选择与筛选的方法，使得人们可以同时检测多个突变体。但是这些方法至今适用于某些蛋白质（尤其是DNA结合蛋白），并且主要集中在研究蛋白质的稳定性。其次，这些筛选方法一般只在活细胞中进行，因而限制了其应用的范围。而复制筛选可以检测细胞中的众多蛋白。但是这些方法的工作量极大，因此只能筛选到为数极少的突变体。81985年，George Smith发表文章显示，EcoRI得到的小肽可以插入丝状噬菌体M13的吸附蛋白的基因III，然后在80年代末90年代初，另一个小组的研究表明：可以把整个蛋白质基因序列插入基因III，并且在噬菌体表面展示出来，而且该蛋白质可以结合同类的配体。而且，通过在噬菌体表面合适的拷贝数的操作，可以产生不同亲和力的蛋白质，从高拷贝数的低亲和力到低拷贝数的高亲和力。这些筛选方法可以在体外一系列选择条件下进行，只受结合到一个support-bound 配体。7从20世纪90年代至今，对展示技术的大量的改进使得文库的规模大大增进（一般）1010 突变体/筛选）,递归突变生成循环使得能够边筛选边突变，一些新的展示形式包括其它噬菌体种类、细菌、酵母与核糖体，并且，自动化进一步简化了流程。当然，噬菌体展示技术对探测、改进与设计新的功能特性进入多肽与蛋白分子其重要作用，这包括：结合亲和力，选择性，催化性，化学与热力学稳定性。最近，由Navagen公司构建的T7噬菌体cDNA表达文库，进一步扩大了噬菌体展示技术的应用范围。T7噬菌体载体是将外源基因序列插入到编码T7噬菌体包膜蛋白基因中，插入片段基因长度可在300 bp 3 000 bp之间，所表达的多肽或蛋白质以与噬菌体包膜蛋白融合的形式展示在噬菌体表面，大小在50个1 200个氨基酸。T7噬菌体展示文库可以展示相当部分表达的蛋白质，甚至可以保持蛋白的一定构象。因此，该系统最大程度地再现了细胞内的真实情况，所筛选出的结合蛋白与自然状态较为接近。目前已被成功应用于蛋白质-蛋白质、抗原-抗体以及DNA-蛋白质之间作用的研究，为功能基因组学的研究提供了一种新的方法。74 噬菌体展示技术的优点 噬菌体展示技术作为一种新兴的研究方法和工具，在研究蛋白质结构上已被广泛应用。它具有很多显著的优点，如： 41,高通量的淘选 将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达1011 PFU），利用抗原-抗体的特异性亲和力将与抗体结合的噬菌体吸附在固相载体上，不能结合的噬菌体仍在溶液中，可以通过洗涤去除，再将特异结合的噬菌体洗脱下来，如此反复数轮扩增、淘选，即可将有用的基因从多达百万以上的噬菌体克隆中分离出来。42,可用于模拟表位的筛选 利用噬菌体展示技术得到模拟表位的报道较多（Giuseppe, 2001；Seshi et al., 2002；Ouyang et al., 2003）。李全喜等（1997）利用单抗9E10筛选噬菌体随机肽库，结果获得了两个阳性克隆，其中一个与抗原天然序列同源，而另一个则完全不同（即为模拟表位）。模拟表位同样可诱发与天然表位相似的特异性免疫反应，例如利用乙肝病毒的模拟表位免疫小鼠可诱导产生高滴度的乙肝病毒抗体。5 43,易于纯化 重组噬菌体的纯化步骤简单、不要求昂贵的试剂与设备，在一般的实验室条件下就可以完成。目前用于鉴定表位和受体所用的噬菌体载体为M13单链噬菌体。由于M13噬菌体是温和型噬菌体，不裂解宿主菌，成熟的噬菌体可分泌到培养基中，通过离心收集培养上清，再向其中加入沉淀剂即可将上清中大量噬菌体粒子沉淀下来，从而富集得到含外源基因产物的重组噬菌体。5 噬菌体展示技术的局限性 尽管如此，在噬菌体展示技术中仍然存在一些不足。1）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在109。 2）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外，鼠源抗体在噬菌体中表达差，也是体内选择压力的一个例子。真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故。 3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。 4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。6 发展趋势九十年代末，生物技术、基因和蛋白质、生物信息和分子文库系统的发展，大大促过了新药发现的技术革命，其中噬菌体展示技术表现出独特的优越性，由此而发展出的一些新方法更是大大的扩展了新药的发现和利用范围。随着噬菌体展示技术在寻找新药道路上的不断成功，这种方法不仅限于人类医药的发现，也可以用于病虫害的防治，畜牧业病害的防治以及水产养殖业病害的防治，特别是在水产养殖业中，可避免滥用抗生素和化学药品，防止水体进一步地污染。很明显，噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白，这将极大地促进生物学和医学研究，因为蛋白颀与其它分子的结合和相互作用是生命现象的主要过程。随着该技术的不断发展和创新，所获得的信息越来越多，如果能与生物芯片技术以及生物信息技术结合起来，其应用范围和能力将会得到更大的发展。参考文献1司犀东，何晓青.噬菌体学.北京：科学出版社，1996.2吴楚，诸慧.噬菌体展示技术.安微农业科学，2009,（03）：990-9923甄永苏，邵荣光.抗体工程药物.北京：化学工业出版社，2002,37-384吕欣.噬菌体在细菌性感染治疗中的应用及展望.国外医学病毒学分册，2002,8（6）190-192.5谢明杰，李太武.噬菌体脱毒机