甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生体系研究.doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页同行评议组别生物化工项目编号Y405474浙江省自然科学基金申 请 书申报类别:一般项目项目名称:甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生体系研究申 请 者:胡忠策电 话托单位:浙江工业大学/生物与环境工程学院通信地址:浙江工业大学生物与环境工程学院邮政编码:310014E-mail :申报日期:2005-5-25浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息申请者信息姓 名胡忠策性别男出生日期1971年11月14日最终学位硕士获学位年份2000职称讲师主要研究领域生物化工E-电 人网页 依托单位浙江工业大学/生物与环境工程学院证件类型身份证证件号码330324711114083申请者是否近三年调入在浙单位工作否调入时间 申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: 项目基本信息项目名称甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生体系研究申报类别一般项目研究属性支撑性应用基础研究同行评议组别材料与化学科学/生物化工依托基地名称浙江省绿色化学合成技术重点实验室-省部共建国家重点-浙江工业大学预计研究年限2006年01月2007年12月总经费预算10.0万元申请经费5.0万元项目研究目标、内容和意义简介(限400字)1,3-二羟基丙酮（1,3-Dihydroxyacetone）是一种大宗的重要化工原料、医药中间体。甘油脱氢酶通过催化甘油2位的羟基氧化成羰基反应，生成二羟基丙酮。在酶催化反应过程中，需要辅酶（NADH）参与。辅酶再生是生物催化与生物转化法生产二羟基丙酮的瓶颈，从过程经济性和产业化可行性出发，建立胞内甘油脱氢酶(整体微生物细胞)催化反应体系，对甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生体系进行深入研究，重点研究辅酶再生体系对甘油脱氢酶酶促反应的影响，以及如何保持细胞内的辅酶再生体系的高效性和稳定性。利用微生物自身的辅酶再生系统，解决甘油脱氢酶催化过程中的辅酶再生问题。该项目的研究，不仅推动生物法生产二羟基丙酮的产业化，更重要的是，为氧化还原酶类生物催化过程中辅酶再生提供新技术，建立整体细胞生物催化与生物转化技术的技术平台，为生物催化与生物转化技术在大宗化学品、医药生产中应用提供专业基础理论知识。关键词（不超过4个）生物催化与生物转化；辅酶再生；甘油脱氢酶；二羟基丙酮同行评议分组说明生物催化与转化 重点资助方向 申请书版本号：93874911 项目组主要成员编号姓名出生日期性别职称学位单位名称电话项目分工每年工作时间（月）（(月)1胡忠策1971年11月14日男讲师硕士浙江工业大学/生物与环境工程学责人82郑裕国1961.11.4男教授博士浙江工业大促反应体系33浮建军1957.2女实验员其他浙江工业大活测定64张建芬1977.10.8女博士生 浙江工业大酶再生研究55张建芬1981.5.7女硕士生 浙江工业大促反应过程66 7 总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数51110111说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第16页个人介绍：胡忠策：胡忠策 男 1971.11生，浙江永嘉人。一，个人简历1989.9-1993.7 浙江大学食品系学习1993.9-1997.7 浙江永嘉职业中学任教1997.9-2000.6 浙江大学食品攻读硕士研究生2000.7-至今 浙江工业大学生物工程研究所工作二，发表的论文：1, Zhong-Ce Hu(胡忠策),Yu-Guo Zheng, Zhao Wang and Yin-Chu Shen. Effect of sugar-feeding strategies on axtaxanthin production by Xanthophyllomyces dendrorhous. World journal Of microbiology & biotechnology. (in press)2, 胡忠策，郑晓冬. 鸡纵菌液体深层发酵的研究. 菌物系统 2002，21（1）：98-101.3, 胡忠策，陈小龙，陈振明，王远山，郑裕国 沈寅初.产井冈胺的微生物菌种的筛选.精细与专用化学品 2002 增刊 167-170.4, 郑裕国，胡忠策. 生物抗氧化剂的生产及发展. 长三角生物医药发展论坛 2004.10 p412-416.5, 陈振明，陈小龙，胡忠策，王远山，郑裕国，沈寅初. 井冈霉素裂解微生物筛选研究初报. 精细与专用化学品 2002 增刊 171-173.6, 王远山，陈小龙，胡忠策，郑裕国，沈寅初. 产腺甘蛋氨酸微生物菌种的筛选. 精细与专用化学品, 2002 增刊 174-176.三，主持与参加的课题1,主持的项目：生物法生产二羟基丙酮 浙江省教育厅项目（20030137），已经结题。2，参与的项目：（1）发酵法生产虾青素, 国家”十五”科技攻关重点项目 (A708B05-03),已鉴定，排名第四。（2）微生物发酵法生产虾青素 浙江省重大攻关项目（011103399），已鉴定，排名第四。 (3) 二羟基丙酮的微生物法生产的研究，浙江省科技厅项目（2003C31071），已经结题，排名第二。（4）新型食品及饲料添加剂开发利用 虾青素生产与应用研究，国家“十五”科技攻关重点项目（2004BA708B05），在研，排名第四。（5）绿色化学农药先导结构及其作用靶标的发现与研究农药先导结构组合衍生和高效活性体的筛选 国家“973”项目（2003CB114402），在研，排名第五。郑裕国： 郑裕国，博士，教授，博士生导师主要代表性论文论著：1Y. G. Zheng, X. L. Chen, Z. Wang, Y. C. Shen, Production of validamycins from crude substrates with dregs by Streptomyces hygroscopicus in an external-loop airlift bioreactor with a low height-to-diameter ratio，Chinese J. Chem. Eng., 2004, 122Zheng, YG, Jin, LQ, Shen, YC, Resin-catalyzed Degradation of Validamycin A for Production of Validoxylamine A，Catalysis Communications, 2004, 53Chen xiaolong，Fan yongxian，Zheng yuguo，Shen yinchu，Properties and Production of Valienamine and Its Related Analogues ，Chemical Reviews，2003，1034Zheng yuguo，Wang zhao，Chen xiaolong，Production of extra-cellular protease from crude substrates with drags in an external loop airlift bioreactor with lower ratio of height to diameter， Biotechnology Progress，2001，175Zheng, YG, Wang, Z, Chen, XL，-Amylase production by Bacillus subtilis with dregs in an external-loop airlift bioreactor，Biochemical Engineering journal：2000,56 Zheng, Y. G., Zhang, X. F., Shen, Y. C. Microbial Transformation of Validamycin A to Valienamine by Immobilized Cells, Biocatalysis and Biotranformation, 2005,37. 郑裕国，王远山，薛亚平，抗氧化剂的生产及应用，化学工业出版社，ISBN7-5025-4822-X/TQ.1827，2004, 18.郑裕国，薛亚平，金利群，生物加工过程与设备，化学工业出版社，ISBN7-5025-5293-6/Q.86，2004，07二，主要在研项目：1国家“973”项目（编号2003CB716005）“生物催化与生物转化-腈水合反应与腈水解反应的方法学及催化机理”2国家自然科学基金（编号20176055）“微生物酶解井冈霉素制备酶抑制剂的酶催化过程的研究”3国家“十五”科技攻关重点项目（编号2004BA708B06）“微生物法生产井冈霉醇胺”4浙江省科技厅项目（编号2003C31071）“二羟基丙酮的微生物法生产的研究” 申请经费预算 5.0 万元 计划开支项目名称计算根据及理由金额（万元）1信息费资料查阅，复印费用。0.12专题学术活动费参加国内学术会议2-3次，会务费，差旅费。0.63仪器和设备购置费溶氧电极膜1个。0.34能源材料费生化试剂，检测试剂等材料费用。3.05计划管理费按照学校有关规定。0.256人员费按照学校有关规定。0.75注：开支范围和标准参见浙江省省级科技项目经费管理暂行办法（浙财教字200220号）。 申请者承诺：我保证： （1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章 日期 .申请书正文甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生体系研究 1、项目研究意义 生物催化与生物转化(biocatalysis & biotransformation)是生物学、化学、过程工程科学的交叉领域, 它是利用生物催化剂（微生物、酶）的催化作用，对底物某一特定的部位化学结构进行改造、修饰，生成结构上相关另一种化合物。其核心目标是大规模采用生物催化剂（微生物或酶）生产化学品、医药、能源、材料等，生物转化技术将是生物技术革命的第三次浪潮1-3。生物催化与生物转化技术涉及的化学反应类型有氧化还原、羟基化、环氧化、氢化、水解、酯化、酯转移、酰化、胺化、脱羟基、脱水、异构化和芳香化等。生物催化与生物转化反应具有如下特点：专一性强、反应条件温和、转化率高、生产工艺简单等特点。随着微生物学、基因组学、蛋白质工程、代谢组学和代谢工程的快速发展，生物催化与生物转化技术得到了快速发展，已经成为国内外研究的热点。生物催化与生物转化技术已经应用于一些农用化学品、精细化学品、大宗化学品、药物及高分子材料的工业化生产4-6。在国内，沈寅初院士利用生物催化与生物转化技术成功开发了首个大宗化学品-丙烯酰胺，在我国的生物催化与生物转化技术在化学品工业上的应用方面做了开创性工作7。精细化工、制药工业是浙江省的重要支柱产业，是今后我省乃至全国重点发展的产业。它在浙江国民经济中占有重要份额，其产值、利润、出口额和税收等多项指标位居全国同行业的前列。目前，浙江省精细化工、制药工业大部分采用化学合成的生产工艺，在化学合成过程中，存在污染重、能耗大、副反应多，生产效率不高等缺点。利用生物催化与生物转化技术生产大宗的化工产品、医药中间体、药物，将是今后发展的趋势；生物催化与生物转化技术具有资源节约性和环境友好性，符合浙江省国民经济可持续发展道路的要求，能提升浙江省精细化工工业、生物制药工业整体技术水平和竞争力。1,3-二羟基丙酮（1,3-Dihydroxyacetone，简称DHA）是一种大宗的重要化工原料、医药中间体。二羟基丙酮由于其有如下特性，得到广泛的应用：（1）DHA分子中含有三个官能团，化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一种重要的化学合成的中间体，也是一个重要的多功能试剂，如能最有效地还原丁二烯-苯乙烯复合物，能有效地催化甲醛到羟醛、羟酮的缩合反应；（2）DHA被广泛应用于化妆品中，能阻止皮肤的水份的过度蒸发，对皮肤起到保湿和防晒作用；在制革工业中，DHA可作为皮革制品的保护剂8-9。生物催化与生物转化甘油（Glycerol）生产二羟基丙酮的研究的反应机理就是，利用微生物产生的甘油脱氢酶(Glycerol Dehydrogenase)通过催化甘油2位的羟基氧化成羰基反应，生成1,3-二羟基丙酮(1,3-Dihydroxyacetone)，其反应过程见图110。使用氧化还原酶进行生物催化反应时, 生成产物的同时会消耗一定量的辅酶, 甘油脱氢酶是属于氧化还原酶类，催化甘油氧化反应生成二羟基丙酮的反应需要辅酶（NADH）参与。辅酶的高效供给是氧化还原酶类生物催化反应在工业化应用中的关键，而辅酶（NADH）的价格昂贵、稳定性低, 从技术经济角度考虑, 在生物催化过程中添加大量的辅酶是不可取的。提供高效、低成本的辅酶再生体系是生物催化与生物转化技术在工业化应用中的关键技术11-14。辅酶再生就是把辅酶从氧化态再生为还原态,或者反之, 从而使辅酶保持在一定的催化剂量水平。辅酶再生有化学、光化学、酶学和电化学等再生体系，在工业化生产其中尤以酶法辅酶再生为主。辅酶的酶法再生包括底物耦联法和酶耦联法。底物耦联法是在反应过程中添加辅助底物(substrate ), 在相同酶的催化下实现目标底物(substrate)和辅助底物(substrate)同时转化，但两者反应方向相反。酶耦联法是利用两个平行的氧化还原酶反应系统, 一个酶催化底物反应,另一个酶则催化辅酶循环再生12。辅酶再生体系在应用过程中可以以游离酶的状态，或者以细胞内的系统两种方式进行再生。游离酶直接再生具有可控性强、使用简单、可以连续操作等优势，但是它的主要缺点是使用纯酶成本过高, 酶的稳定性不高、使用寿命有限，反应体系稳定性不高，很难在工业化生产中得到应用。应用微生物细胞内自身的酶法再生体系，是辅酶再生领域的一个新的研究热点，也是一条可以实现工业化生成的技术路线13-15。为了有效解决甘油脱氢酶在酶催化反应过程中的辅酶再生问题，申请者拟采用微生物细胞内甘油脱氢酶作为生物催化剂，利用微生物细胞自身的辅酶循环与平衡系统来解决辅酶再生问题。跟游离酶生物催化与生物转化反应相比，利用整体细胞进行生物催化与生物转化反应，具有一定的优点：(1)减少了酶的分离、纯化过程。(2)许多生物催化与生物转化反应需要胞内多酶体系来完成，这些反应极难在非细胞内状态下得以重现。(3)完整细胞可在其代谢过程中产生各种辅酶，以及能保持辅酶再生循环，使各种催化反应得以顺利进行。但是，由于细胞中的酶系复杂、种类繁多，利用整体细胞进行催化反应也有不少缺点：副反应多；底物和目的产物可能会被微生物细胞进一步利用，导致转化率下降，目的产物难以大量积累；底物与产物的扩散、传质等影响反应速率的问题15。利用胞内甘油脱氢酶（整体细胞）生物转化甘油生产二羟基丙酮也同样遇到这些问题，甘油、二羟基丙酮会被细胞内其他酶催化反应产生其他物质，必须在反应过程中有效控制甘油、二羟基丙酮被细胞进一步利用。能产生甘油脱氢酶的微生物主要有醋酸杆菌（Acetobacter）和葡萄糖杆菌（Gluconobacter）等等，甘油脱氢酶主要存在于微生物细胞膜上。已经有文献报道甘油在醋酸杆菌中的代谢情况，甘油经甘油激酶的催化反应生成甘油-3-磷酸，然后进入糖酵解途径，为菌体细胞的生长、繁殖提供前体物质和能量。甘油在甘油脱氢酶的作用下生成二羟基丙酮，二羟基丙酮在二羟基丙酮激酶作用转变成二羟基丙酮磷酸，然后进入戊糖磷酸循环途径11。甘油脱氢酶NAD+NADH 图1，甘油脱氢酶催化反应过程本项目将对甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生体系进行深入研究，重点研究辅酶再生体系对甘油脱氢酶酶促反应的影响，以及如何保持整体细胞内的辅酶再生体系的高效性和稳定性。从过程经济性和产业化可行性出发，建立胞内甘油脱氢酶催化反应体系，深入研究细胞内甘油脱氢酶催化甘油生成二羟基丙酮的反应机理，利用微生物自身的辅酶再生系统，解决甘油脱氢酶催化过程中的辅酶再生问题。2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系；（1）研究目标研究微生物自身的辅酶再生体系的稳定性和高效性，以及辅酶对甘油脱氢酶酶促反应的影响，解决甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生问题。着力提高甘油脱氢酶酶促反应的反应速率、提高二羟基丙酮产率。建立胞内甘油脱氢酶酶促反应体系，研究细胞内甘油脱氢酶的酶促反应过程及反应机理，建立酶促反应动力学模型。（2）与申请者研究工作长期目标的关系申请人在生物转化法生产二羟基丙酮方面已作了大量的研究工作，我们的长期目标：不仅是解决生物转化法生产二羟基丙酮过程中的辅酶再生问题，从而推动生物转化法生产二羟基丙酮项目产业化，为浙江的相关企业提供高新产品生产技术；更重要的是通过本项目的研究，为解决氧化还原酶类在生物催化过程中有关辅酶再生问题提供的新技术、新知识，建立胞内氧化还原酶类（整体细胞）生物催化与生物转化技术平台，为整体细胞生物催化与生物转化技术在大宗化学品、医药中间体、药物的生产实践提供理论基础和技术支持。这是申请人在生物催化与生物转化方面研究的长期目标。3、项目研究内容，研究方案和进度安排一、主要研究内容(1) 本实验室已经从土壤中分离、筛选能高产甘油脱氢酶的微生物菌株，根据甘油在微生物中的代谢途径，定向、推理选育高产甘油脱氢酶的微生物突变株；研究微生物高产甘油脱氢酶的培养条件。(2) 培养得到微生物细胞，利用胞内甘油脱氢酶（整个微生物细胞）作为生物催化剂，建立甘油脱氢酶酶促反应体系，研究反应体系的稳定性、高效性。重点研究辅酶再生体系的稳定性、高效性，以及辅酶再生体系对反应的影响。 (3) 利用工程数学、反应过程分析等知识，研究甘油脱氢酶催化甘油生成二羟基丙酮的反应机理及其反应动力学，对甘油脱氢酶催化甘油生成二羟基丙酮的反应条件进行优化，研究各种因子（温度、pH、底物、产物）对酶促反应的影响，得到较佳反应工艺条件，提高二羟基丙酮的产率。 二、主要研究方案(1)本实验室已经从土壤中筛选到几株能高产甘油脱氢酶的微生物菌种，采用等离子注入技术筛选高产甘油脱氢酶的微生物菌株，得到高产甘油脱氢酶的突变菌株。(2)通过微生物大规模培养技术，得到甘油脱氢酶活性高的微生物菌体，以该菌体为生物催化剂，比较游离细胞与固定化细胞催化反应体系的优缺点，选择更适合工业化大规模生成的反应体系。 （3）通过微量的营养物质供给和环境条件的控制，保持微生物细胞一定的生理活性状态，通过CO2尾气分析，测定微生物细胞的呼吸商，来判断微生物细胞的呼吸强度与生理活性。分析微生物呼吸强度等生理特征与细胞内NADH含量的关系。保持微生物自身的辅酶再生系统、呼吸链能高效运转，保障甘油脱氢酶催化反应能高效进行。（4）通过研究甘油、二羟基丙酮、NADH在反应体系中的变化，研究细胞内甘油脱氢酶的酶催化过程，研究催化反应的机理，得到酶催化反应动力学曲线及其酶促反应动力学参数。三、关键技术和技术难点(1) 提高甘油脱氢酶催化反应体系的稳定性、高效性，经济性。如何保持微生物一定生理活性，保证辅酶的高效供给，以及辅酶再生体系对甘油脱氢酶酶促反应的影响。 (2)对菌体进行特定的遗传改造后，菌体的遗传稳定性和生理特性会改变，会影响甘油脱氢酶的催化反应过程及辅酶再生问题。四、项目年度研究计划安排(1) 2006.01-2006.12 对已有菌株进行遗传改造，考察突变菌株的稳定性。(2) 2007.01-2007.12 建立胞内甘油脱氢酶酶催化反应体系，研究酶催化过程中的辅酶再生体系，以及辅酶再生体系对酶催化反应的影响。(2) 2008.01-2008.12 考察各种因素对甘油脱氢酶催化反应的影响，研究甘油脱氢酶催化反应动力学。整理数据，总结验收。4、项目创新之处 辅酶再生就是把辅酶从氧化态再生为还原态,或者反之, 从而使辅酶保持在一定的催化剂量水平。辅酶再生问题是氧化还原酶类工业化应用的瓶颈问题，已经有不少文献报道辅酶再生体系的研究：辅酶再生有化学、光化学、电化学和酶学等再生系统，在工业化生产应用其中主要是酶法再生。辅酶的酶法再生包括底物耦联法和酶耦联法，辅酶酶法再生体系在应用过程中以游离酶的状态,或者以细胞内的系统两种方式进行再生11-12。生物转化甘油生成二羟基丙酮的研究，在国外已经有文献报道16-19。这些研究中，主要侧重于生物转化甘油生成二羟基丙酮的工艺条件研究，有关细胞内甘油脱氢酶的反应体系及其辅酶再生体系的研究，未见文献报道，然而辅酶再生体系对于甘油脱氢酶酶促反应是至关重要的。二羟基丙酮是大宗的化学品，是以万吨级别计量的。从产业化的可行性来分析，要选用高效、价廉、稳定的辅酶再生体系。由于辅酶（NADH）价格昂贵、稳定性差，采用游离酶直接再生，但是很难在工业化应用中使用游离辅酶再生。采用整体细胞的自身的辅酶体系，通过代谢调控改变细胞内辅酶的再生，Lopez de Felipe et al提出了“辅酶因子工程”（cofactor engineering）20，构建了NADH氧化酶高表达的工程菌，从而改变了细胞内NADH/NAD+比例，改变了葡萄糖的代谢。本申请者也曾经研究讨论过，在产甘油脱氢酶的微生物菌株中插入NADH氧化酶基因，构建NADH氧化酶高效表达的基因工程菌，从而实现NADH/NAD+循环，解决甘油脱氢酶酶促反应工程中的辅酶（NADH）问题，这一反应体系从理论上分析，是一个很理想的反应体系，适用于反应体系很小的研究。但是，在工程实践中，二羟基丙酮是万吨级的大宗化学品，反应体系很大，很难利用基因工程菌进行大规模、工业化生产。这是由于基因工程菌在大规模生产过程中不稳定，反应体系的稳定性不高，最终导致甘油脱氢酶酶活的下降。经国内著名生物化工专家指点，申请者采用整体细胞催化反应体系，利用微生物自身的辅酶再生体系，通过环境和营养条件控制来实现对辅酶再生体系的调控，实现胞内甘油脱氢酶催化反应高效进行。而且，采用整体细胞进行生物催化与生物转化技术生产大宗化学品已经有成功的例子，这些成功的例子为本项目的完成提供借鉴意义17,21。本课题的提出来源于生产实践的需要，从过程经济性和工业可行性方面出发，来设计整体研究的技术路线和实验方案，研究胞内甘油脱氢酶催化反应体系中辅酶再生问题，解决了甘油脱氢酶工业化应用的瓶颈问题。其研究结果不仅直接应用于生产实践；更重要的是，研究胞内甘油脱氢酶（整体细胞）生物转化甘油生成二羟基丙酮的反应体系，认识甘油脱氢酶进行脱氢反应的基本过程及特点，充分利用细胞原来的呼吸链和辅酶再生体系，为微生物氧化还原酶类催化反应提供理论依据。 用整体、系统的思维来研究胞内酶催化反应的特性，把细胞的生理活性状态、辅酶再生体系与胞内甘油脱氢酶的催化反应过程有机的结合起来，将胞内甘油脱氢酶反应体系的特性与整体细胞的特性有机结合起来。有助于我们加深认识胞内甘油脱氢酶催化特性及催化机理。5、工作基础与工作条件 本项目组从1999年起开始进行甘油生物转化制备1，3-二羟基丙酮的研究工作，从土壤中筛选得到了能够高效催化甘油生产二羟基丙酮的微生物菌株，对生物转化法生产1，3-二羟基丙酮的工艺过程进行了优化，在研究中发现辅酶的再生对甘油脱氢酶反应有重要作用。在进行了大量前期研究的基础上，提出了本项目的研究思路和技术方案。本项目已作了大量的前期研究，已取得阶段性结果：目前已经建立快速筛选高产甘油脱氢酶的微生物菌株的技术平台，利用这个技术平台，本实验室已经从土壤中筛选到几株能高产甘油脱氢酶的微生物菌株；已建立了甘油脱氢酶的酶活分析检测方法，二羟基丙酮的分离提取方法、甘油和二羟基丙酮的分析检测方法；已经发表了研究论文。申请者所在的实验室是学校重点投资建设的实验室，实验设备先进，拥有多台高速冷冻离心机，BIO-RAD层析仪，生物分子定量测定，研究型生物显微镜， 多台仪高效液相色谱、气相色谱。本实验室具备完成本项目的各种硬件条件。申请者所在的学科是浙江省重点建设的“重中之重”学科，申请者所在创新团队已承担多项“973”项目、国家“十五”攻关项目、国家自然科学基金、浙江省自然科学基金等省部级课题。而且，本课题组曾经承担过多项有关生物催化与生物转化反应的研究课题，积累了不少酶催化反应与生物转化反应的科研经验，也取得了一定的科研成果。本课题组成员已合作研究多年，知识结构合理、分工明确，合理，团队协作精神好，能按时保质完成研究任务。 6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路 本项目预期的研究结果是研究论文。通过本项目的研究，能阐明胞内甘油脱氢酶催化反应过程中辅酶再生机制，认识甘油脱氢酶的反应机理，以及酶促反应动力学，建立整体细胞生物转化甘油生成二羟基丙酮的反应体系与反应机制。本项目的技术路线完全是基于过程的经济性和工业化的可行性考虑，利用本项目的研究结果，能有效解决生物转化法生产二羟基丙酮的关键问题，大大推动工业化大规模生产二羟基丙酮的进展，早日实现产业化。更加重要的是，通过本项目的研究，阐明胞内甘油脱氢酶酶促反应过程中的关键问题-辅酶再生机制，利用整体细胞自身的辅酶再生系统解决氧化还原酶类进行生物催化过程中的辅酶再生问题，其研究成果可以为其他氧化还原酶的催化反应的研究提供理论知识和借鉴意义，为氧化还原酶类生物转化生产大宗化学品、药品，提供理论依据和技术支持。建立整体微生物细胞反应体系，构建整体细胞生物转化的技术平台，为生物转化技术的应用提供技术支持。 7、参考文献1 卢定强, 韦萍, 周华, 贾红华,欧阳平凯. 生物催化与生物转化的研究进展. 化工进展,2004, 23（6）: 585-589.2 刘成柏, 程瑛琨, 于大海, 王智. 酶催化技术开发及应用的研究进展. 生物加工过程. 2004. 2（1）: 7-15.3 Rozzell J. D. Commercial Scale Biocatalysis: Myths and Realities. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1999, 7: 2253-2261.4 Panke S. & Wubbolts M. Advances in biocatalytic synthesis of pharmaceutical Intermediates. Current Opinion in Chemical Biology, 2005, 9: 188-194.5 Straathof A. J. J, Panke S. and Schmid A. The production of fine chemicals by biotransformations. Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13: 54-556.6 Schoemaker H.E., Mink D, and Wubbolts M.G. Dispelling the Myths-Biocatalysis in Industrial Synthesis. Science, 2003, 299: 1694-1697.7 沈寅初, 张国凡, 韩建生. 微生物法生产丙烯酰胺. 工业微生物. 1994, 24（2）: 24-32.8 Green S. R., Whalen E. A., Molokie E. Dihydroxyacetone: Production and Uses. Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering, 1961, 3(4): 351-355.9 Bories A., Claret C. & Soucaille P. Kinetic study and optimisation of the Production of dihydroxyacetone from glycerol using Gluconobacter oxydans. Process Biochemistry, 1991, 26: 243-248.10 Claret C., Salmon J.M., Romieu C., Bories A. Physiology of Gluconobacter oxydans during dihydroxyacetone production from glycerol. Applied Microbiology and Biotechnology, 1994, 41: 359-365.11 张羽中, 邢新会. 辅酶再生体系的研究进展. 生物工程学报, 2004, 20（6）: 811-816.12 Wichmann R. and Vasic-Racki D. Cofactor regeneration at the lab scale. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 2005, 92: 225-230.13 Zhao H. and Donk W.A. Regeneration of cofactors for use in biocatalysis. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14: 583589.14 Donk W.A. and Zhao H. Re