T-cadherin基因失活与原发性肝癌恶性生物学特征的关系及其临床意义.doc

国家自然科学基金申请书您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本文档或打印了申请代码：受理部门： 收件日期：受理编号：第 20 页 版本1.009.485国家自然科学基金申 请 书资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 者： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮件： 申报日期： 2004年3月9日国家自然科学基金委员会基本信息yEKHuo0AOsK申 请 者 信 息姓名性别 出生年月 年 月民族 学位 职称 主要研究领域 电话 电子邮件 传真 个人网页 工作单位 在研项目批准号 依托单位信息名称代 码43007402 联系人张婷姣 电子邮件 电网站地址 合作单位信息单 位 名 称代 码00000000 项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 申请代码C03030303:普通外科学C03031901:实验肿瘤学基地类别 预计研究年限2005年1月 2007年12月研究属性应用基础研究 摘 要项目研究内容和意义简介（限400字）：细胞粘附分子T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实T-cad基因在脑胶质母细胞瘤C6细胞中的肿瘤抑制基因功能，并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究T-cad基因失活与肝癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌标本中研究T-cad基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明确T-cad基因失活与临床肝癌预后的关系；在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化药物是否能重新诱导T-cad分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。关 键 词(用分号分开，最多5个)T-cadherin；肿瘤抑制基因；肝癌 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏)编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮件项目分工每年工作时间（月）1 2 3 4 5 6 7 8 9 总人数高级中级初级博士后博士生硕士生10321121说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费17.50001.科研业务费2.9000（1）测试/计算/分析费0.5000统计分析及数据处理费（2）能源/动力费0.4000水电费（3）会议费/差旅费1.0000参加国内学术会议4-5人次（4）出版物/文献/信息传播费1.0000论文准备及发表（5）其它2.实验材料费5.5000（1）原材料/试剂/药品购置费4.0000购置各种抗体、脂质体（2）其它1.5000购买氚标胸腺嘧啶、去甲基化试剂、合成引物3.仪器设备费4.5000（1）购置3.0000购买小型冰冻切片机、动物解剖器材及消耗性器材（2）试制1.5000各种常规试剂4.实验室改装费2.0000建立动物解剖工作台及同位素实验专区5.协作费2.6000委托动物中心维持约100只裸鼠约1年的饲养及管理；流试细胞仪分析二.国际合作与交流费3.50001.项目组成员出国合作交流1.0000参加国际会议一次2.境外专家来华合作交流2.5000邀请Gutmann教授来院指导课题进展及专题讲座2-3次三.劳务费四.管理费1.0000合 计22.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000 国家自然科学基金申请书报告正文（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系, 其发生发展与多种癌基因过度表达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后， 进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。T-cadherin分子属细胞粘附分子cadherin超家族。 Cadherin超家族分子为细胞表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的Cadherin分子如E-cadherin和N-cadherin由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成，而T-cadherin因缺失经典Cadherin分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名truncated-cadherin（即T-cadherin，又称CDH13或H-cadherin）。近年来对经典的Cadherin分子的深入研究发现，E-，N-cadherin分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8,9,10）。将E-cadherin分子重新导入缺失E-cadherin分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受抑（11）。近年已开始有T-cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13，14，15,16,17,18），推测T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能及其分子机制进行研究。2003年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将T-cadherin基因导入缺失表达T-cadherin分子的大鼠脑胶质母细胞瘤C6细胞使其过度表达T-cadherin分子，C6细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实T-cadherin在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是T-cadherin分子通过诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578（19）。这一研究发现为进一步研究T-cadherin分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20，21，22，23）。T-cadherin基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于其启动子异常甲基化导致T-cadherin基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺失（13,16,24）。T-cadherin基因位于染色体16q24，肝癌的发生与染色体16q24的缺失、突变密切相关(25)。 Riou （2002）对位于染色体16q24的13个常常在肝癌中缺失表达的基因的转录研究发现，T-cadherin mRNA在HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和HA22TNGH四种肝癌细胞株中缺失表达，但T-cadherin基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002）进一步研究显示T-cadherin基因启动子在肝癌中高度甲基化，而E-cadherin基因启动子在肝癌中不发生甲基化，表明在Cadherin细胞粘附分子超家族中T-cadherin基因启动子甲基化在肝癌中具有高度特异性,且T-cadherin基因启动子甲基化与T-cadherin基因失活密切相关（26）。这些研究表明T-cadherin基因启动子甲基化是T-cadherin基因在肝癌中失活的主要机制。Takeuchi在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与2ug/ml去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine共孵6天能使皮肤鳞癌细胞株恢复T-cadherin分子表达（17）。但目前对T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导T-cadherin分子在肝癌细胞株中重新表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。本研究将进一步研究T-cadherin在肝癌中的基因功能，调查缺失表达T-cadherin的肝癌细胞株重新表达T-cadherin是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，进一步揭示T-cadherin基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导T-cadherin分子表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究T-cadherin基因与C6细胞恶性生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。主要参考文献：1. Angst BD, Marcozzi C and Magee AI. The cadherin superfamily: diversity in form and function. J Cell Sci., 2001, 114:629-6412. Kemler R. Classic cadherins. Semin. Cell Biol., 1992,3:149-1553. Koller E, Ransch B. Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells. J Biol Chem.,1996,271:30061-300674. Takeichi M.Cadherin cell adhesion receptor as a morphogenetic regulator. Science 1991,251:1451-14555. Angst, B.D., Marcozzi, c., and Magee, A.L. The T-cadherin superfamily: diversity in from and function. J.Cell Sci 2001, 114:629-6416. Berx, G., and. Van Roy, F. The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper in breast cancer tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001, 3:289-293. 7. Bremnes, R. M., Veve R., Gabrielson, E. et al. High-throughput tissue microarray analysis used to evaluate biology and prognostic significance of the E-cadherin pathway in non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2002,20: 2417-2428.8. Handschuh, G., Candidus S., Luber B., et al. Tumour-associated E-cadherin mutations alter cellular morphology, decrease cellular adhesion and increase cellular motility. Oncogene 1999, 18:4301-4312.9. Levenberg, S., Yarden A., Kam Z., et al. p27 is involved in N-cadherin-mediated contact inhibition of cell growth and S-phase entry. Oncogene 1999,18: 869-876.10.Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma : correlation with genetic alteration, beta-catenin expression, and clinical features. Hepatology 2002,36:692-70111.Vleminckx, K., Vakaet L., Mareel Jr. M., et al. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressor role. Cell 1991,66: 107-119. 12. Riou P, Saffroy R, Comoy J, et al. Investigation in liver tissues and cell lines of the transcription of 13 genes mapping to the 16q24 region that are frequently deleted in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res. 2002 Oct;8(10):3178-86.13. Sato, M., Mori, Y., Sakurada, A., et al. The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer. Hum Genet 1998,103:96-10114. Lee, S.W. H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished expression in human breast cancer. Nat. Med 1996,2:776-78215.Zhong,Y., Delgado, Y., Gomez, J., et al. Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clin. Cancer Res 2001,7:1683-168716.Toyooka S, Toyooka KO,Harada K, et al. Aberrant methylation of the CDH13(H-cadherin) promoter region in colorectoral cancers and adenomas. Cancer Res 2002,62:3382-338617.Takeuchi T, Liang SB, Matsuyoshi N, et al. Loss of T-cadherin(CDH13, H-cadherin) expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Laboratory Investigation 2002, 82:1023-102918.Kawakami M,Staub J,Cliby W ,et al. Involvement of H-cadherin(CDH13) on 16q in the region of frequent deletion in ovarian cancer. Int J Oncol 1999,15:715-72019.Huang ZY, Wu, Y., Hedrick, N., and Gutmann, D.H. 2003. T-cadherin-mediated cell regulation ivolves G2 phase arrest and requires p21 CIP1/WAF1 expression. Molecular and cellular Biology 2003,23:566-57820.Yang B, Guo M, Herman JG, et al. Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppressor genes in hepatocellular carcinoma.Am J Pathol. 2003 ,163:1101-7.21.Baldwin, RL, Nemeth, E, Tran, H, et al. BRCA1 promoter region hypermethylation in ovarian carcinoma: a population-based study. Cancer Res 2000, 60: 53295333.22.Simpson, DJ, Hibberts, NA, McNicol, AM, et al. Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RB1 CpG island. Cancer Res 2000, 60: 12111216.23.Wiencke, JK, Zheng, S, Lafuente, A, et al. Aberrant methylation of p16INK4a in anatomic and gender-specific subtypes of sporadic colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999, 8: 501506.24. Toyooka, K.D., Toyooka,S., Vimani, K., et al. Loss of expression and abrrent methylation of the CDH13 (H-cadherin)gene in breast and lung carcinomas., Cancer Res 2001,61:4556-456025.Marchio A, Meddeb M, Pineau P, et al. Recurrent chromosomal abnormalities in hepatocellular carcinoma detected by comparative genomic hybridization.Genes Chromosomes Cancer. 1997,18:59-65.26.Yu J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002, 2:292、项目的 研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题一、研究T-cadherin在肝癌中的基因功能1.将T-cadherin基因导入缺失表达T-cadherin的肝癌细胞株HepG2，使其表达T-cadherin分子，研究表达T-cadherin分子的肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化，证实是否T-cadherin重新表达能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征。2.将缺失表达T-cadherin的HepG2细胞和转染后表达T-cadherin 的HepG2细胞于皮下接种裸鼠，在裸鼠肝癌模型上进一步证实T-cadherin基因的肿瘤抑制基因功能。3研究T-cadherin基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制。证实是否T-cadherin在肝癌细胞株存在与在C6细胞中一致的分子机制，即T-cadherin分子通过诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肝癌细胞于细胞周期G2期阻滞。二、 在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，在人肝癌中揭示T-cadherin基因失活与肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。1.研究50例临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织中T-cadherin的表达，揭示T-cadherin基因表达水平（失活）与肝癌恶性分化程度、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。2.结合临床病案记录，选择在临床分期、病理类型及治疗方法上具有可比性的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或肝外转移以及2年 内未复发或肝外转移的肝癌病例的石蜡标本各20例，研究T-cadherin基因的表达，揭示T-cadherin基因表达水平（失活）与肝癌复发和转移的关系。三、在肝癌细胞株和裸鼠肝癌种植模型上证实去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine是否能重新诱导T-cadherin表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其对肝癌的治疗价值和可能的毒副作用。3、拟采取的研究方案及可行性分析一、研究T-cadherin（T-cad）在肝癌中的基因功能的技术路线1.构建T-cad表达载体pcDNA3.T-cad 以脂质体lipofectin为载体转染肝癌细胞系HepG2细胞 以G418筛选表达T-cad分子的阳性克隆 Western blot鉴定转染后T-cad蛋白表达比较表达T-cad的阳性克隆与不表达T-cad的肝癌细胞的生物学特征:细胞增殖计数 3H标胸腺嘧啶摄取率测定克隆增殖试验细胞粘附试验细胞聚集试验2.在裸鼠肝癌模型上观察T-cad阳性克隆与不表达T-cad的肝癌细胞的生物学特征a.裸鼠皮下分别接种107 T-cadherin（+）或（-）的肝癌细胞（各20只）b.观察：肿瘤生长速度肿瘤转移发生的时间、累及积器官及频率裸鼠的生存期3.研究T-cadherin基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制a.流式细胞仪检测表达T-cadherin阳性和阴性的肝癌细胞的细胞周期变化b.Western blot检测细胞周期调控蛋白p53,p21,p27,cyclin D的表达变化c.研究是否T-cadherin分子在肝癌中同样存在诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肝癌细胞于细胞周期G2期阻滞的分子机制。二、研究T-cadherin基因失活与临床肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系的技术路线1.收集临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织各50例a. 检测T-cadherin表达： 定量PCR；免疫组织化学；Western blot b.比较肝癌与癌周肝组织中T-cadherin的表达水平，研究T-cadherin缺失表达（基因失活）与人肝癌发生的关系。c. 比较不同病例肝癌中T-cadherin的表达水平，研究T-cadherin表达水平与肿瘤病理分级、肝内转移（包括合并门静脉癌栓和卫星灶形成）的关系。2.结合临床病案记录，选择临床分期相同、病理类型一致、单个肿瘤大小在25cm之间、无肝内外转移、行根治性切除后采用同样的治疗方案的肝癌病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或转移以及2年内未复发或转移的肝癌石蜡标本各20例 a. 检测T-cadherin表达： 免疫组织化学b. 回顾研究T-cadherin表达水平与肿瘤复发和转移的关系三、研究去甲基化药物诱导T-cadherin表达及其治疗学意义的技术路线。1.研究表明T-cadherin在肝癌细胞株HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和HA22TNGH中缺失。采用Herman已报导的检测T-cadherin启动子甲基化和非甲基序列的引物，进一步证实T-cadherin在上述肝癌细胞株中的启动子甲基化现象。扩增甲基化序列引物，上游5-TCGCGGGGTTCGTTTTCGC-3，下游5-GACGTTTTCATTCATACGCG-3，扩增非甲化序列引物，上游5-TTGTGGGGTTGTTTTGT-3，下游5-AACTTTTCATTCATACACACA-3。 采用Western blot进一步证实T-cadherin在上述存在的启动子甲基化肝癌细胞株中蛋白水平表达缺失。2.选择T-cadherin启动子高度甲基化的细胞株与去甲基化药物5-aza-2-deoxycytidine（2ug/ml）作用6天后，采用Western blot检测T-cadherin蛋白水平表达; 采用细胞增殖计数、3H标胸腺嘧啶摄取率测定、克隆增殖试验、细胞粘附试验和细胞聚集试验检测T-cadherin表达前后肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的变化。3.将T-cadherin启动子高度甲基化的细胞株（细胞数1x107）分别接种60只裸鼠后随机分成两组（每组30只），治疗组再分成五组（每组6只），每组分别按0.5ug、1ug、2ug、4ug、8ug/克体重每日皮下注射5-aza-2-deoxycytidine，共注射一周，对照组仅注射生理盐水，观察不同组裸鼠的肿瘤生长速度、肿瘤转移发生的时间、累及器官及频率及裸鼠的生存期。4、项目的特色及创新之处1近年已开始有T-cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌及结直肠癌中表达显著下降、缺失的报导，推测T-cadherin分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色。 申请人（黄志勇）最新研究首次证实T-cadherin在大鼠脑胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并首次揭示其肿瘤抑制功能的分子机制（Huang Zhiyong等，Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578）。但目前尚无人对T-cadherin在肝癌中的基因功能及其分子机制进行研究。基于申请人前期世界领先的研究工作基础，该研究将进一步揭示T-cadherin分子在肝癌中的基因功能和其分子机制，具有世界先进性和独创性。2. Cadherin分子，如E-，N-cadherin分子缺失或突变与多种肿瘤的发生及转移特征密切相关，但目前对T-cadherin基因失活与肝癌的侵犯及转移等生物学特征的关系目前尚无研究，该研究具有先进性和独创性。3.T-cadherin基因启动子甲基化在肝癌中具有特异性,且 T-cadherin基因启动子甲基化与T-cadherin基因失活密切相关。但对应用去甲基化药物诱导T-cadherin表达并研究其对肝癌的治疗学意义目前尚无研究。该研究具有创新性和实用性。4.该研究的独到之处在于揭示最新肿瘤抑制基因T-cadherin基因失活与肝癌恶性生物学特征的关系以及去甲基化药物对肝癌的治疗作用，该研究对进一步揭示肝癌发生发展的分子机制、研究更有效的治疗药物具有重要的科学及临床意义。5、年度研究计划及预期研究成果研究计划及进度：2005.1-2005.12 在肝癌细胞株和裸鼠肝癌模型上研究T-cadherin在肝癌中的基因功能。证实是否T-cadherin抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征。揭示T-cadherin基因表达抑制肝癌细胞恶性生物学特征的分子机制。2006.1-2006.12 在临床切除的肝癌标本中研究T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，揭示T-cadherin的肿瘤抑制基因功能失活与临床肝癌的恶性生物学特征及预后的关系。2007.1-2007.12在肝癌细胞株和裸鼠种植肝癌模型上研究去甲基化药物是否能重新诱导T-cadherin表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其对肝癌的潜在的治疗价值治疗作用和可能的毒副作用。预期研究成果：1.在国际上有影响的刊物发表论文3-4篇，在国内权威期刊上发表论文8-10篇。2.预期科研成果3项：a.T-cadherin基因在肝癌中的基因功能及其机制b.T-cadherin基因失活与肝癌恶性生物学特征的关系c.利用去甲基化试剂诱导T-cadherin表达对肝癌的治疗学价值（二）研究基础与工作条件1、工作基础：申请人从事肿瘤发生的分子机制，肝癌的免疫及基因治疗研究多年，发表研究论文19篇，其中6篇被SCI收录，影响因子多达40。在美国华盛顿大学神经肿瘤及分子遗传研究室从事神经系统肿瘤发生的分子机制的研究工作近4年，主要从事脑胶质细胞瘤发生、发展的分子机制，利用基因芯片寻找与脑胶质细胞瘤发生发展相关的遗传改变，并利用已知的脑胶质细胞瘤的遗传改变，如Ras激活突变， NF1基因缺失，cdk4过表达，P53及Rb缺失，并在动物模型上进一步验证上述遗传改变与脑胶质细胞瘤发生发展的关系。首次利用GFAP启动子成功地建立了脑胶质细胞特异性CDK4基因过表达的动物模型，并揭示了CDK4过表达与P53基因缺失对脑胶质细胞增殖的协同作用。该文发表于Oncogene 2002, 21:1325-1334（影响因子 6.0）。该CDK4转基因鼠系正在申请美国专利。同时，探索研究新基因如T-cadherin和GAP43基因对脑胶质细胞瘤生长、转移等恶性生物学特征的关系，首次发现T-cadherin和GAP43是两个重要的参与脑胶质细胞瘤生长调控的基因，并揭示其调节机制。论文分别发表于 Molecular and Cellular Biology 2003, 23:566-578（影响因子 8.8）和Cancer Research 2003, 63:2933-2939（影响因子 8.3）。参加在美国和印度召开的国际会议3次，在研究基因功能与肿瘤恶性生物学特征的关系、肿瘤发生的分子机制及治疗研究领域积累了丰富的经验。在对T-cadherin基因的研究中，首次证明了细胞粘附分子T-cadherin是抑制脑胶质细胞瘤生长及转移等恶性生物学特征的重要肿瘤抑制基因，并揭示其分子机制是T-cadherin分子通过诱导P21 CIP1/WAF1表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578。这一研究发现为进一步研究T-cadherin分子在肝癌中的作用、功能及临床意义奠定了坚实的基础。2 前期关于T-cadherin研究的基础工作：图1. 胶质母细胞瘤C6细胞转染T-cadherin基因后细胞增殖受抑。A.Western blot显示转染T-cadherin基因后成熟型（105kDa）和前体（130kDa）T-cadherin分子在C6细胞中的表达。而转染空载体pcDNA3的C6细胞不表达T-cadherin。B.以同样摩尔数的pcDNA3.T-cadherin和pcDNA3转染C6细胞后14天，前者培养皿中形成的细胞克隆数显著低于后者。C.克隆计数显示二者有极显著统计学差异（P0.01）。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图2. 转染后过度表达T-cadherin分子的不同C6细胞克隆的增殖均显著受抑。A. Western blot证实T-cadherin成熟型分子（105KDa）和前体分子（130KDa）在转染C6细胞后的T3、T9、T13克隆细胞中的表达。B.直接细胞计数显示在培养第7天，与转染空载体的V2、V3克隆相比，T3、T9、T13克隆的细胞增殖显著受抑。且其增殖受抑的程度与T-cadherin的表达水平成正相关。C.与转染空载体的C6克隆V2、V3相比，过表达T-cadherin的C6克隆细胞（T3、T9、T13）在软琼脂中形成的克隆数显著减少。*表示有极显著统计学差异。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图3. T-cadherin在C6细胞中过表达增强细胞伸展性及粘附能力，降低细胞纤移能力。A.与不表达T-cadherin的C6细胞相比，T-cadherin过表达的C6细胞在Laminin包被的玻片上显示良好的细胞伸展性。B.与不表达T-cadherin的C6细胞相比，T-cadherin过表达的C6细胞在种植于fibronectin包被的培养皿后1小时和4小时时，均显示显著增强的细胞粘附能力。*表示有极显著统计学差异。C.与不表达T-cadherin的C6细胞相比，T-cadherin过表达的C6细胞在Boyden Chamber中的纤移能力显著下降。*表示有极显著统计学差异。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图4. T-cadherin过表达C6细胞呈现细胞聚集特征。A.过表达T-cadherin的C6细胞显示广泛的细胞聚集。B.过表达T-cadherin的C6细胞的聚集指数与不表达T-cadherin的C6细胞的聚集指数有极显著差异。*表示有极显著统计学差异。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图5. 流式细胞仪分析表明过表达T-cadherin的C6细胞克隆于G2/M期细胞数显著增加。A.过表达T-cadherin的C6细胞克隆T3、T9和T13及转染空载体后不表达T-cadherin的C6细胞经无血清培养48小时同步后，以血清刺激培养12小时后测定DNA含量。箭头显示2N（G1），4N（G2/M）和8N DNA的位置。B.过表达T-cad的C6细胞克隆和不表达T-cad的C6细胞克隆在G1、S和G2/M期的细胞分布，过表达T-cad的T3、T9克隆于G2/M期细胞数显著高于不表达T-cad的C6细胞克隆V2、V3。C.过表达T-cad的C6细胞显示更多的异倍体细胞（aneuploid，4N）。D.异倍体细胞数的比例与G2/M期细胞的百分比直接相关（R2=0.9723）。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图6. 过表达T-cadherin的C6细胞于G2/M期细胞的百分比显著升高。A.过度表达T-cadherin的T3克隆和不表达T-cadherin的V2克隆在血清刺激0、12、24和48小时后，DNA含量测定。B.V2克隆C6细胞在G1、S和G2/M期的分布。C.T3克隆C6细胞在G1、S和G2/M期的分布，G2/M期细胞比例显著升高。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图7. 分裂指数分析显示T-cadherin过表达诱导C6细胞于细胞周期G2期阻滞。A.转染空载体的C6细胞（V2克隆）与转染T-cadherin基因后表达T-cadherin的C6细胞（T3克隆）经无血清培养同步化后，以含10%血清的培养基培养0、4、8、12、24和48小时后测定细胞分裂指数。与V2细胞相比，T3细胞在每个时间点均显示较低的分裂指数。B.对于V2克隆，G2/M期细胞的百分比分别与在12、24和48小时测定的分裂指数一致。而T3克隆，G2/M期细胞的百分比显著高于在相同时间点测定的分裂指数。*表示有极显著统计学差异（P0.01）。C.应用Propidium iodide细胞核染色显示，与空载体转染的C6细胞相比，转染后过表达T-cadherin的C6细胞的细胞核显著增大、变圆，提示其细胞分裂受抑。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578图8. T-cadherin介导的C6细胞增殖抑制依赖于P21CIP1/WAF1表达，但与P53表达无关。A.Western blot显示过表达T-cadherin的C6细胞克隆T3、T9和T13细胞的P21CIP1/WAF1表达显著升高，且P21CIP1/WAF1的表达水平与T-cadherin的表达水平成正相关。但T-cadherin的过表达与P27Kip1表达无直接相关性。Tubulin用作加样对照。B.克隆增殖试验显示T-cadherin过表达能抑制3T3细胞增殖，但不能抑制缺失P21CIP1/WAF1的3T3细胞的增殖。*表示有极显著统计学差异（P0.01）。C.克隆增殖试验显示T-cadherin过表达抑制成纤维细胞增殖，无论其是否表达P53。*表示有极显著统计学差异（P0.01）。黄志勇等,Molecular and Cellular Biology,23:566-578已发表的相关论文:1.Huang Zhi-yong, YanLi Wu, Nicole Hedrick and David H.Gutmann. T-cadherin-mediated cell regulation involves G2 phase arrest and requires p21CIP1/WAF1 expression. Molecular and Cellular Biology, 2003, 23:566-578 （影响因子 8.8）2. Huang Zhi-yong, YanLi Wu, Stephen P. Burke and David H. Gutmann. The 43 kDa growth-associated protein functions as a negative growth regulator in glioma. Cancer Res, 2003, 63: 2933-2939 （影响因子 8.3）3. Huang Zhi-yong, Rebecca L.Baldwin,Nicole M.Hedrick and David H. Gutmann. Astrocyte specific expression of cdk4 is not sufficient for tumor formation, but cooperates with p53 heterozygosity to provide a growth advantage for astrocytes in vivo. Oncogene, 2002,21:1325-1334 （影响因子 6.0）4.David H. Gutmann, Huang Zhi-yong, Nicole M.Hedrick, Hao Ding, Abhijit Guha and Mark A. Watson. Mouse glioma gene expression profiling identifies novel human glioma -associated genes. Annals of Neurology, 2002,51:393-405 （影响因子 8.6）5.David H. Gutmann, Hirbe,A.C., and Huang zhi-yong and Carrie A.Haipek. The protein 4.1 tu