微生物量碳氮.doc

微生物量碳 方法一 每个土样称取相当于 20g 烘干土重的 6 份新鲜湿土于100ml 烧杯中，其中三份作为对照，直接用 100ml 0.5 molL-1 K2SO4（87.13g定容到1L）浸提。另三份放入干燥器中熏蒸，干燥器底部放适量水（保湿）和三个 50ml 小烧杯，一个烧杯盛 25ml 1% NaOH溶液（1g NaOH加入99ml水），另两个各盛 25ml 无醇氯仿（投入少量沸石）。盖严干燥器盖，将干燥器置于通风橱内，抽真空，直至氯仿沸腾约 2min，而后置于25暗室中 24h，取出盛氯仿的小烧杯，盖严干燥器盖，反复抽真空以除去残余的氯仿。采用灭菌提取法，从干燥器中取出土样，同对照一样放入150ml 三角瓶中，分别加入100ml 0.5 molL-1 K2SO4溶液，25下在往复式震荡机上振荡30min，过滤。滤液用德国产TOC仪测定土壤提取液全碳含量，以熏蒸和未熏蒸土壤提取液全碳含量的差值Fc乘以系数2.64得到土壤微生物碳的含量，计算公式为：方法二 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K2SO4溶液可提取成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数KEC来估计土壤微生物碳。二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（0.5 molL-1）：取871.25 g分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10 L。（2）0.2 molL-1（1/6 K2Cr2O7）标准溶液：称取130烘2-3小时的K2Cr2O7（分析纯）9.806 g于1 L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1 L。K2Cr2O7较难溶解，可加热加快其溶解。 （3）0.1000 molL-1（1/6 K2Cr2O7）标准溶液：取经130烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903 g，用蒸馏水溶解并定溶至1 L。 （4）邻啡罗啉指示剂：取邻啡罗啉指1.490 g溶于含有0.700 g分析纯硫酸亚铁（FeSO47H2O）的100 ml蒸馏水中，此溶液易变质，应密闭保存于棕色瓶中。 （5）硫酸亚铁标准溶液（0.05 molL-1）：称取13.9 g分析纯硫酸亚铁（FeSO47H2O），溶于800 ml蒸馏水中，慢慢加浓硫酸5 ml（防止水解），定溶至1 L，保存于棕色瓶中。此溶液易被空气氧化，每次使用时必须标定其准确浓度。 硫酸亚铁溶液标定方法：吸取0.1000 molL-1（1/6 K2Cr2O7）标准溶液5.0 ml（浓度为0.05 molL-1，1/6 K2Cr2O7），放入150 ml的三角瓶中，加浓硫酸5 ml和邻啡罗啉指示剂2滴，用硫酸亚铁溶液滴定，滴至溶液由蓝绿色变为棕红色即为终点。根据滴到终点消耗的硫酸亚铁溶液量计算其准确浓度，即C2=(C1*V1)/V2。式中：C1重铬酸钾标准溶液浓度（0.1000 molL-1） C2硫酸亚铁标准溶液浓度（molL-1） V1吸取的重铬酸钾标准溶液体积（5 ml） V2滴到终点时消耗硫酸亚铁溶液体积（ml） （6）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1：2（V:V）加入分液漏斗中，充分摇动1分钟，慢慢放出底层氯仿于烧杯中。如此洗3次。得到的纯氯仿用无水氯化钙出去氯仿中的水分，于试剂瓶中在低温（4）黑暗状态可保存几周（Williamss等，1995）三. 操作方法（1）土样前处理： 新鲜土壤应立即处理或保存于4冰箱中，测定前仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（蚯蚓等），过筛（孔径2 mm），彻底混匀。处理过程应尽量避免破坏土壤结构，土壤含水量过高应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。土壤湿度不够可以用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。次样品即可用于土壤实时测定。开展其他研究（如培养试验）可将土壤置于密闭的大塑料桶内培养7-15天，桶内应有适量水以保持湿度，内放一小杯1 molL-1 NaOH溶液吸收土壤呼吸产生的CO2，培养温度为25。经过前培养的土壤应立即分析。如果需要保留，应放置于4的冷藏箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24小时。这些过程为消除土壤水分限制对微生物的影响，及植物残体组织对测定的干扰。 土壤饱和持水量测定可按Shaw（1958）的方法：在圆形漏斗茎上装一带夹子的橡皮管，漏斗内塞上玻璃纤维塞，取50g土壤于漏斗中，夹紧橡皮塞，加入50ml水保持30分钟，然后打开夹子并测定30分钟内滴下的水的体积，加入的水量减以滴下的水量再加原来土壤中含的水量即为该土壤的饱和含水量。（2）土壤熏蒸 称取经前处理的新鲜土壤（含水量为饱和持水量的40%）3份25.0 g（烘干基重）土样于50 ml烧杯中，用去乙醇氯仿熏蒸，方法是将其置于底部有少量水（约200 ml）和去乙醇氯仿（40 ml）的真空干燥器中，氯仿加入烧杯中，并在其中放入经浓硫酸处理的碎瓷片（0.5 cm大小，防爆）。在-0.07 MPa真空度下使氯仿剧烈沸腾3-5分钟后，关闭真空干燥器阀门，移置在25黑暗条件下熏蒸土壤24小时；然后将土壤转入另一干净真空干燥器中，反复抽真空（-0.07 MPa）6次，每次3分钟，彻底出去土壤中氯仿（残留在土壤中的氯仿对提取碳的测定有较大的影响）。 在熏蒸同时，另取3份25.0 g（烘干基重）土壤于125 ml提取瓶中（为不熏蒸对照）。由于熏蒸过程需要24小时，因此通常在熏蒸时，将不熏蒸土壤可置于4条件下保存。（3）土壤提取 将除去氯仿后的熏蒸土壤转移到125ml提取瓶中，与不熏蒸土壤同时采用50 ml可调加液器加入100 ml 0.5 molL-1 K2SO4提取液，水土比为1：4，并设3个试剂空白。如果采用重铬酸钾氧化法测定提取液中有机碳，也可采用2：1的水土比，即加入50 ml 0.5 molL-1 K2SO4提取液。在往复式振荡器中振荡提取30分钟，再用定量中速滤纸过滤于50ml塑料瓶中，贮藏于-18冷冻柜中，待测。经贮藏的土壤提取液解冻后会有一些白色沉淀，据推测为CaSO4和K2SO4，对提取液中有机碳的测定没有影响，可以不必除去这些白色沉淀（Brookes等，1985）。（4）提取液中有机碳含量测定和土壤微生物碳计算：方法：重铬酸钾氧化法（林启美等1999；Vance等1987）吸取10ml上述土壤提取液于经过仔细检查的150ml消化管（24*295mm）中，加入5.0ml 0.2 molL-1 K2Cr2O7，5.0 ml浓H2SO4溶液，再加入少量经浓硫酸处理的碎瓷片（3mm大小，防爆），混匀，置于1751磷酸浴中煮沸10分钟，应注意消煮的时间应保证准确一致。冷却后将溶液转移到150ml三角瓶中，使总体积约为80ml，加入1滴邻啡罗啉指示剂，用0.05 molL-1硫酸亚铁标准溶液滴定消煮液中剩余的重铬酸钾，滴定过程为先由橙黄色变为蓝绿色，再变为棕红色，即到达终点。结果计算：提取的土壤有机碳（mgCkg-1土）= 0.012/4*106*M*(V0-V)*f /W式中：M 为FeSO4溶液浓度（molL-1）； V0、V 分别为滴定空白和样品消耗的FeSO4溶液体积（ml）； f 为稀释倍数； W 为烘干土重（g）； 0.012 为碳毫摩尔质量（g）； 106 为换算系数。土壤微生物碳：Bc=Ec/Kc式中：Bc 代表土壤微生物碳（mgCkg-1）； Ec 熏蒸土壤提取的有机碳-不熏蒸土壤提取的有机碳，单位mgCkg-1； Kc 为转换系数，采用重铬酸钾氧化法取值0.38（Vance等，1987）。微生物量氮 每个土样称取相当于 20g 烘干土重的 6 份新鲜湿土于100ml 烧杯中，其中三份作为对照，直接用 100ml 0.5 molL-1 K2SO4浸提。另三份放入干燥器中熏蒸，干燥器底部放适量水（保湿）和三个 50ml 小烧杯，一个烧杯盛 25ml 1% NaOH 溶液，另两个各盛 25ml 无醇氯仿（投入少量沸石）。盖严干燥器盖，将干燥器置于通风橱内，抽真空，直至氯仿沸腾约 2min，而后置于25暗室中 24h，取出