RNA的制备及纯度的鉴定ppt.ppt

生物制药09303第七组指导老师 陈芬 一 操作方法 背景知识 核糖核酸 简称RNA 主要以单链的形式存在于生物体内 其高级结构很复杂 它们既担负着储藏及转移遗传信息的功能 又能作为核酶在细胞内发挥代谢功能 生物体内共有三种RNA 即编码特定蛋白质序列的信使RNA 能特异性解读mRNA中的遗传信息 将其转化成相应氨基酸后加入多肽链中的转运RNA 直接参与核糖体中蛋白质合成的核糖体RNA mRNA的选择性拼接合成类RNA RNA的生物合成RNA DNA诊断仪 实验目的 1掌握从动物组织中提取RNA的基本原理和操作2掌握RNA纯度鉴定的原理和基本操作3进一步熟悉可见分光光度计的使用 实验原理 细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起 以核蛋白的形式存在 因此分离RNA时必须使RNA与蛋白质解离 并除去蛋白质 最常用含水的酚溶液除去蛋白质 去污剂和酚均能抑制RNA酶活力 有利于制备核酸大分子 以酚水两相系统分离RNA是将细胞或细胞器置于含有SDS的缓冲盐溶液中 加等体积水饱和的酚 通过剧烈振荡 然后离心形成上层水相和下层酚相 实验所用的0 15mol L缓冲盐溶液系统可使大部分核糖核蛋白解离 在用酚处理时脱氧核糖核蛋白变性 在低温条件下 从水相中除去 这样得到的RNA制品中混杂的DNA量极低 RNA制品继续用氯仿 异戊醇处理 可以进一步除去其中含有的少量蛋白质 最后用乙醇使RNA自水溶液中沉淀下来 实验所得制品的核酸含量可用地衣酚显色法测定RNA含量 RNA与浓盐酸共热时 即发生降解 形成的核糖继而转变为糠醛 后者与3 5 二羟基甲苯 地衣酚 反应呈鲜绿色 该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂 反应产物在670nm处有最大吸收 RNA在20 250g范围内 光吸收与RNA的浓度成正比 实验器材与试剂 器材 乳钵 磨口具塞锥形瓶 500ml 天平 离心机 4000rpm 动物肝脏 紫外可见分光度计 恒温水浴锅 试剂 1 SDS 缓冲盐溶液 0 3 SDS 0 1mol L氯化钠 0 05mol L pH5 0乙酸盐缓冲液 称取1 5gSDS 2 92g氯化钠 2 05g乙酸钠溶于水中 用乙酸调至pH5 0 最后定容至500ml 2 含水酚液 使用前将苯酚重蒸 酚的沸点为181 8 并用SDS 缓冲盐溶液使其饱和 3 氯仿 异戊醇液 氯仿 异戊醇 24 1 V V 4 含2 乙酸钾的95 乙醇溶液 5 75 乙醇 95 乙醇 无水乙醇 6 乙醚7 RNA标准溶液 须经定磷确定其纯度 取酵母RNA配成200g mL的溶液 8 地衣酚试剂 先配制0 1 三氯化铁的浓盐酸 分析纯 溶液 实验前用此溶液作为溶剂配成0 1 地衣酚溶液 实验步骤 一 实验前的准备mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解 加上RNA酶极为稳定而且广泛存在 因此在提取过程中应严格防止RNA酶的污染并设法抑制其活性 所用的玻璃器皿需要置于干燥烘箱中200 0 C烘烤两小时以上 凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0 1 的焦碳酸二乙酯 DEPC 水溶液处理 再用蒸馏水冲净 RNA提取流程 二 实验过程1 取2g动物肝脏组织 剪成小块 在乳钵种研碎 加20mLSDS 缓冲盐溶液 见试剂1 使成均浆 倒入磨口具塞锥形瓶内 再加同样体积的含水酚溶液 室温下剧烈振荡10分钟 2 置冰浴中分层 在0 4 下 以4000rpmn离心15分钟 吸出上清液 加等体积氯仿 异戊醇 室温下剧烈振荡10分钟 以4000rpm离心5分钟 或在室温下放置10分钟使分层 吸出上清液 若有必要 该操作可反复多次 加2倍体积2 乙酸钾的乙醇溶液 在冰浴中放置1小时使RNA沉淀 此沉淀液可在冰箱内较长期存放 3 若要得到干燥制品 可将沉淀液以4000rpm离心10分钟 倾去上清液 沉淀用少许75 乙醇 95 乙醇 无水乙醇各洗1次 同上法离心 倾去乙醇后 空气干燥 4 将RNA 准确称取30mg左右RNA干燥制品 溶于5 10mL蒸馏水中 离心除去不溶性杂质 得RNA粗品 5 RNA纯度的鉴定一 RNA标准曲线的制定取8支试管 编号 按表加入试剂 加毕 摇匀 置沸水浴中加热15min 冷却 测OD670值 以OD670值为纵坐标 RNA含量 ug ml 为横坐标绘制标准曲线 二 制品的测定取0 2 0 5ml制品液于试管中 加蒸馏水稀释至2ml 然后加2ml地衣酚试剂摇匀 于沸水中煮沸15分钟 冷却 测OD670 根据测得的吸光度 从标准曲线上查出相当该吸光度的RNA的含量 三 RNA含量的计算根据测得的光吸收值 从标准曲线上查出相当该光吸收值的RNA含量 按下式计算出制品中RNA的百分含量 样品液RNA含量 ug ml 标准曲线查到的值 稀释倍数 操作参照表 注意事项 1 在操作中当加入变性剂氯仿后 为了保证核酸样品的完整性 操作要轻 尤其在提DNA时 更要避免剧烈操作2 在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇 乙醇的极性要强于异丙醇 所以一般用2V乙醇沉淀 但在多糖 蛋白含量高时 用异丙醇沉淀可部分克服这种污染 尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖 杂蛋白污染更为有效 3 在提取核酸时 如样品浓度低 则应增加有机溶剂沉淀时间 70 下 30min 20 过夜将有助于增加核酸的沉淀量 4 RNA通常用分光光度计定量 测量在260nm处的吸收值 A260 通常分光光度计A260的读数要介于0 15 1 0之间才是可靠的 因此RNA提取结束后 要根据大概产量稀释到适当浓度范围 再用分光光度计测量 A260为1相当于RNA的浓度为40 g ml 问题及答案 一 提取制备RNA常用的方法有那几种 主要有苯酚 异硫氰酸胍 CTAB LiCl密度梯度 Trizol等方法 二 制备RNA应注意哪些问题 1 整个过程应注意预防RNA酶的污染2 匀浆后加氯仿之前样品可以在 60至 70 保存至少一个月 三 地衣酚反应中 干扰RNA的测定因素有哪些 如何能减少