细菌鉴定方法.doc

1.2.1 形态学特征 按照东秀珠和蔡妙英编常见细菌系统鉴定手册（1999），中科院微生物所编著一般细菌常用鉴定方法（1978）的方法进行鉴定。芽孢杆菌属鉴定到种，参照了蔡妙英等译芽孢杆菌属（1980）的方法。（1）革兰氏染色：挑选少许菌苔，涂布于干净玻片的蒸馏水中，风干固定，结晶紫染色（结晶紫2g，草酸铵0.8g，95%乙醇20 ml，加水至100 ml）1min，水洗后碘液（碘1g，碘化钾2g，水300 ml）作用1min，水洗，脱色，用番红O液染3min，水洗，风干，光学显微镜观察。（2）鞭毛染色：将1624h菌龄的菌苔在载玻片上的水滴中轻蘸几下，将玻片倾斜，使菌液缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。干燥后滴甲液（丹宁酸5g，FeCl3 1.5g，15%福尔马林2ml，1%NaOH 1ml，蒸馏水100 ml）染610min，水洗，干燥后，用乙液（2%AgNO3 溶液）加热复染30min，蒸馏水冲洗，干燥，镜检，菌体为深褐色，鞭毛为褐色。（3）运动性：半固体琼脂穿刺法，将菌种接在可使鉴定菌生长良好的培养基中，其中含0.30.6%的琼脂。适温培养，运动性可用透射光目测，如生长菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表明鉴定菌无运动性；如生长菌由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘呈云雾状，则表示鉴定菌有运动性。（4）芽孢染色：孔雀绿染色法。按革兰氏染色涂片后，用饱和的孔雀绿水溶液（约7.6%）染20 min，水冲洗后在用0.5%番红O复染2030s，水洗，吸干，镜检。芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。（5）抗酸染色：常规涂片，石碳酸复红（10%碱性复红乙醇饱和液10 ml，5%石碳酸水溶液100 ml）加热染色5 min，倾去染液用酸性乙醇脱色，吕氏美蓝（2%亚甲基蓝乙醇饱和液30 ml，0.01%KOH 100 ml。）复染2min，水洗，吸干，镜检。（6）荚膜染色：在载片一端滴一滴无菌水，取少许菌苔在水滴中制成悬液。取一滴墨汁与菌悬液混合，并用另一载片之一端将此水滴在载片上刮成薄膜风干。用纯甲醇固定1min，加0.5%番红O液数滴滴于涂片上，冲去残余甲醇，并染30s，然后倾去染液，立即吸干，镜检。1.2.2 培养及生理特性（1）菌落形态：用划线法将菌种接在平板培养基上，适温培养12d，出现单菌落开始观察，包括形状和大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落和培养基的颜色等。（2）生长温度和耐热性：将菌种转接到几支试管中，分别在不同温度下培养，每处理2管，目测生长情况。（3）芽孢菌厌氧性测定：将菌种用外径为1.5mm的接种环穿刺接种在厌氧培养基（酪素水解物20g，NaCl 5g，巯基醋酸钠2g，甲基次硫酸钠1g，琼脂15g，蒸馏水1000 ml），30培养，3d和7d分别观察，表面生长者为好氧菌，如沿穿刺线或下部生长者为兼性厌氧菌或厌氧菌。（4）碳源利用：将菌种接种在各种碳源斜面培养基（MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）H2PO4 H2O 0.5 g ，K2HPO4 0.5g，CaCl22H2O 0.1g，（NH4）2SO4 2.0 g ，蒸馏水1000 ml，碳源分别为蔗糖、乳糖、果糖、木糖、半乳糖、甘露醇等，终浓度为0.1%0.2%）上，适温培养1d，以菌悬液接种，能生长者即培养基变浑浊为阳性，否则为阴性。（5）氮源利用：将菌种接种在各种氮源斜面培养基（MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）H2PO4 1 .36g ，Na2HPO4 2.13g，CaCl2 5.00 ml，FeSO47H2O 0.50 ml，葡萄糖10.0 g ，蒸馏水1000 ml），氮源分别为氨态氮如磷酸氢二铵或硝态氮如硝酸钾、乳糖、果糖、木糖、半乳糖等，终浓度为0.2%0.5%）上，适温培养1d，以菌悬液接种，能生长者即培养基变浑浊为阳性，否则为阴性。（6）柠檬酸盐利用：将菌种接种在柠檬酸盐斜面培养基（NaCl 5g，MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）H2PO4 1 g ，K2HPO43H2O 1g，柠檬酸钠2g，0.04%酚红10ml，琼脂12g，蒸馏水1000 ml）上，适温培养37d，培养基变为桃红色者为阳性，否则为阴性。（7）耐盐性和需盐性：将菌种分别接种在含3%，5%，7%，10% 含NaCl的肉汁胨液体培养基中，适温培养3d、7d，目测生长情况。（8）丙酸盐利用：将菌种接种在丙酸盐斜面培养基上（丙酸钠2g，NaCl 5g，MgSO47H2O 0.2 g ，（NH4）HPO4 1 g ，K2HPO43H2O 1g，0.04%酚红 10ml，琼脂12g，蒸馏水1000 ml）上，适温培养37d，培养基变为桃红色者为阳性，否则为阴性。1.2.3 生化特性测定（1）氧化酶：将1%的四甲基对苯二胺水溶液滴于干净培养皿的滤纸上，滤纸湿润即可，用牙签取1824h的菌苔涂抹于湿润滤纸上，在10s内涂抹的菌苔呈蓝色为阳性，60s以上呈蓝色者不计，按阴性处理。（2）接触酶：将24h培养的斜面菌种，用牙签取菌苔涂抹于已滴有3%过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡产生为阴性。（3）葡萄糖氧化发酵：将24h幼龄菌种穿刺接种于休和利夫森试管培养基（蛋白胨2g，NaCl 5g，葡萄糖10g，琼脂6g，溴百里酚蓝少许，蒸馏水1000ml），每株4支，其中2支上面覆盖凡士林石蜡油，适温培养1d、3d、7d、14d观察，只有开管变黄者为氧化型，开管和闭管均变黄者为发酵型。（4）甲基红（MR）：培养48h的菌种试管培养液（蛋白胨5g ，葡萄糖5g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.07.2）中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红阳性反应，黄色为阴性反应。（5）V-P测定：将培养24h的菌种培养液（培养基成分同甲基红）与40%NaOH 等量相混，加入少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才能出现红色。（6）淀粉水解：将菌种接在淀粉琼脂培养基（在肉汁胨中加入0.2%的可溶性淀粉）上，培养25d，形成明显菌落后，将碘液滴在平板上，观察菌落周围有无透明圈。菌落周围如有不变色的透明圈，表示淀粉水解阳性；仍蓝色为阴性。（7）脲酶：将培养3d的斜面菌苔做成菌悬液，加入一滴酚红指示剂，调pH至7，使液体呈红色，分成2份，其中1份加入0.1g尿素，几分钟后指示剂变红者为阳性，不变为阴性。（8）苯丙氨酸脱氨酶：将菌种接在苯丙氨酸斜面培养基（酵母膏3g，NaCl 5g， Na2HPO4 1g，琼脂12g，L-苯丙氨酸1g，蒸馏水1000ml）上，37培养824h测定，将10%的FeCl3 溶液滴在生长菌的斜面上，变绿为阳性反应，不变为阴性反应。 （9）明胶液化：将菌株接种在明胶液化培养基（蛋白胨5g，明胶150g，水1000ml，pH 7.07.2）上，2528培养，于5、10、20、30d观察液化程度。 （10）牛奶分解：将新鲜菌种接于石蕊牛奶（2.5%石蕊水溶液，脱脂牛奶100 ml）中，2528培养，于3、5、10、20、30d观察，还原-石蕊褪色变白；胨化-牛奶变清；产酸-石蕊变红；产碱-石蕊变蓝；酸凝和酶凝-牛奶结块、凝固。（11