论文修改版20140326.doc

11文章编号:DOI: HA基多孔复合支架的制备及其表征贾治彬1, 智伟2，李金羽2，刘剑阳3，盛璐瑶3，许韬韬3，翁杰 （材料先进技术教育部重点实验室，材料科学与工程学院，西南交通大学，成都，610031)摘要：本文利用造孔剂法制备了高度贯通的多孔羟基磷灰石（HA）支架，孔隙率约为78%，并利用聚己内酯（PCL）分别复合纳米HA（nHA）或微纳米生物玻璃（nBG）对其进行涂覆改性，旨在改善其力学性能和生物学性能，并保持其孔隙贯通性和高孔隙率。复合涂层以PCL为基底，nHA粉末或nBG粉末的添加量分别均为1040wt%。四种类型支架分别记为HA、HA/PCL、HA/PCL-nHA和HA/PCL-nBG。实验结果发现，HA/PCL-nHA和HA/PCL-nBG复合支架抗压强度分别为1.411.98MPa和1.351.78MPa，并且含量均为30wt%时取得最大值，相对于多孔HA支架抗压强度0.64MPa其最大抗压强度分别提高了约3.1倍和2.78倍。四类支架在模拟体液（SBF）中的矿化实验显示，浸泡21d后HA/PCL-nHA和HA/PCL-nBG表面促进较多的磷灰石生成；细胞实验结果显示细胞在四类支架上生长良好，说明支架具有良好的生物相容性。关键词：羟基磷灰石支架；复合涂层；聚己内酯；生物玻璃；抗压强度；生物相容性Preparation and Representation of the porous composite scaffolds which based on HA scaffoldsJiaZhibin1，ZhiWei2，LiJinyu2 ，LiuJianyang3，ShengLuyao3，XuTaotao3，WengJie，(Key Laboratory of Advanced Technologies of Materials.Ministry of Education，College of Materials Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，ChengDu，610031)Preparation and Modification of Porous Hydroxyaptite Ceramic Scaffolds by Sugar Spheres Leaching MethodAbstract：Highly interconnected porous hydroxyapatite(HA)scaffolds with high porosity(78%)were prepared by particle leaching method in the present work， and then the as-prepared HA scaffolds were lined with PCL containing nHA or micronano-bioglass composite layer to improve there mechanical properties and biological properties and reserve there high porosity at the same time. The composite layer were based on the Polycaprolactone(PCL)polymer solutions and the content of the single component of nano-hydroxyapatite powder or micronano-bioglass powder(nBG) was arranged from 10wt% to 40wt%. The four types of scaffolds were signed as HA、HA/PCL、HA/PCL-nHA and HA/PCL-nBG. The experimental results showed that compressive strength of HA/PCL-nHA and HA/PCL-nBG were 1.411.98 MPa and 1.351.78 MPa，respectively(increased 3.1 times and 2.78 times respectively compared to the original HA scaffolds with 0.64 MPa)，and the maximum were achieved when the content was 30%. The biomineralization result in the simulated body fluid (SBF)indicated that after immersed in SBF for 21d，much apatite layer were found on the surface of HA/PCL-nHA and HA/PCL-nBG scaffolds. Cell culture experiment result showed that Oblast growed well on all scaffolds，which explained the scaffolds possessed remarkable biological compatibility.1引言多孔羟基磷灰石（(Ca10(PO4)6(OH)2，HA）陶瓷支架因其优良的生物相容性、生物活性和引导骨生长能力等广泛应用于非承力骨缺失修复和骨组织工程支架。作为细胞黏附和骨细胞外基质形成的模板，多孔支架的贯通性、孔隙形态、孔径和孔隙率等因素对支架的生物学表现具有非常重要的影响1-3。鉴于颗粒制孔法在调控孔隙结构工程中的优点，我们在前期研究中采用了糖球和蜡球等作为制备造孔剂，成功制备出贯通性良好的多孔HA支架4。但是，由于高的孔隙率使得单一陶瓷成分的多孔支架力学性能往往较低，所以采取不同复合技术改善多孔陶瓷支架的研究受到了广泛关注。J. Zhao 5等制备的HA/PCL复合支架抗压强度相对于HA支架而言提高了近一倍，并显示出良好的生物活性。生物玻璃因其具有优良的生物活性已广泛应用于骨组织工程。Monireh Kouhi 6等人制备的PCL/BG复合支架拉伸强度达到3.45 MPa，比PCL支架的2.3 MPa提高了1.15 MPa，良好的力学性能和生物活性使得复合支架在骨组织工程具有极大的应用潜力。综合以上情况，本文利用采用糖球粘结、注浆工艺制备贯通性良好、孔隙率高的多孔HA支架，然后利用聚己内酯（PCL）分别与纳米羟基磷灰石（nHA）和微纳米生物玻璃（nBG）的复合涂层，涂覆多孔HA支架以提高其抗压强度和生物学性能。采用扫描电镜（SEM）观察、抗压强度测试、模拟体液（SBF）生物矿化评价和体外细胞实验等手段综合考察复合涂层对多孔HA支架的改性效果。2.实验部分2.1 材料HA支架制备所需原料包括：硝酸钙、磷酸氢铵。糖球采用市售食糖采用乳液法制得，过筛后粒径在800m1200m之间。甲壳素（CT）、氮氮二甲基乙酰胺（DMAc）、无水氯化锂（LiCl）等。复合涂层用nHA粉末购于四川大学国家生物材料工程中心，平均粒径约为150nm；nBG粉末（45S5）由华南理工大学材料科学与工程学院提供。nHA和nBG粉末形貌如图1所示。二氯甲烷（CH2Cl2），聚己内酯（PCL，平均分子量100，000）、模拟体液（SBF）。图1 nHA（a）和nBG（b）粉末扫描照片Fig.1 SEM of nHA（a）and nBG（b）powder2.2 HA原料粉末合成及多孔HA支架的制备采用常规溶液共沉淀法合成HA粉末7，其过程简述如下：按照Ca/P化学计量比1.67，称取590.25g的Ca(NO3)24H2O和198.08g的(NH4)2HPO4分别溶于5L去离子水，得到的Ca(NO3)2溶液为2.5mol/L，(NH4)2HPO4溶液为1.5mol/L。将Ca(NO3)2水溶液直接加入反应容器中，调整合适的搅拌速度对其进行搅拌。然后用氨水滴定Ca(NO3)2水溶液，将pH值控制在11左右。同时向上述溶液中以合适的速度滴入(NH4)2HPO4溶液和NH3H2O，控制pH值在11左右，滴加完成后让溶液继续搅拌78小时后静置7d以确保HA的完全生成。之后用去离子水漂洗至HA上清液pH值为7，抽滤、球磨、过筛收集HA粉末备用。HA粉末粒径5m。采用注浆法制备多孔HA支架，步骤如下：将5g LiCl加入到100mL DMAc中，待其完全溶解后加入0.7gCT，磁力搅拌24h至CT完全溶解，再加入25gHA粉末，连续搅拌24h使其成为均匀的HA/CT溶胶。将糖球紧密堆积在圆形塑料注射器模具内，并在60电烘箱中热处理7min；然后将HA/CT溶胶加入到模具内，待模压成型后将支架取出置于无水乙醇中浸泡使其进一步固化；取出固形体置于40去离子水反复洗涤以出去糖球，并滴定氯离子被清除干净，将支架切成两种圆柱形（16x16mm和16x32mm），最后在常温下干燥后获得多孔HA支架初坯；初坯再在1200下烧结2h获得多孔HA陶瓷支架，得到两种支架（尺寸分别约为8x8mm和8mmx16mm）。2.3复合支架的制备称取一定量的PCL溶于CH2Cl2溶剂，使PCL溶液浓度为10%（w/v）。配制三份上述溶液，并向其中的两份分别加入一定量的nHA和nBG粉末，搅拌24h，使用前超声半小时。将已制备的多孔HA陶瓷支架浸泡于溶液中一分钟，取出离心，重复三次，将各型支架分别置于无水乙醇中浸泡1min，然后将复合支架置于37烘箱中烘干 2.4性能表征2.4.1支架的宏观结构和微观结构实验中用扫描电镜（scanning electron microscope，SEM，型号为QUANTA200）观察支架的宏观结构和微观结构。2.4.2生物矿化本文将各型支架浸泡于SBF中考察其体外生物活性。将四种支架按固体/液体=150 mg/L分别置于37 SBF中浸泡7d、14d、21d、28d。矿化过后将支架取出，用去离子水洗净，然后置于37烘箱中烘干备用。2.4.3支架力学性能测试选取尺寸约为8x16 mm的圆柱形支架，用万能力学试验机（型号为5567 Q4052）测定支架的抗压强度，加载速率为0.5mm/min，每组测定3个样品。2.4.4细胞实验多孔支架经环乙烷灭菌后分放入24孔板，用灭过菌的PBS溶液浸泡后，放入CO2培养箱中备用。成骨细胞扩增到实验所需数量后，加入含0.1%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液，离心后计数，将细胞密度调整为2 x105个/mL。将上述备用的24孔板中的磷酸缓冲液(PBS)用吸管吸出，每组接种0.05 mL 细胞悬液，然后补加含15%小牛血清的MEM培养基。在细胞培养的第1、3、5、7d，分别用Alamar Blue对其进行检测。培养7 d后弃去培养基， 用PBS冲洗2次，梯度脱水脱醇处理后临界点干燥，喷金后用SEM观察多孔支架表面上成骨细胞的形貌。4结果与讨论4.1支架的结构采用糖球制孔法制备出的HA多孔支架孔径分布较为均匀，孔径尺寸主要在900m左右，贯通窗口尺寸在200m左右（图1a），支架陶瓷骨干晶粒尺寸在2m左右，孔隙表面具有大量微孔（图1b）。电镜形态观察证实所制备的多孔HA支架具有优良的贯通性，有利于细胞的渗入、转移、营养物质的运输和代谢物质的排出，对组织的有效长入也有重大积极作用。对HA支架进行涂覆过程中，当nHA和nBG含量在30%（相对于PCL）或以下时，粉末能够被PCL包覆（图3（d）和3（f），当含量高于该临界值时会发生严重团聚，如图2（g）所示，这种团聚的发生会给支架的力学性能带来负面影响。实验结果显示，涂覆过后复合支架孔隙率76%，满足骨组织工程支架的要求，因此涂覆过程不会对支架产生负面影响。图2 支架涂覆前后表面结构扫描照片: (a)(b)为HA支架；(c)(d)(g)为HA/PCL-nBG支架；(e)(f) 为HA/PCL-nHA支架.Fig.2 SEM of scaffolds：(a)(b)HA；(c)(d)(g)HA/PCL-nBG composite scaffold；(e)(f) HA/PCL-nHA composite scaffold.4.2支架的力学性能实验结果显示，HA支架最大抗压强度为0.64MPa，涂覆PCL后，抗压强度增大到1.04MPa；当加入nHA（1040wt%）和nBG（1040wt%）之后的抗压强度分别为1.411.98MPa和1.351.78MPa，最大值均在30wt%时取得，这是由于适量的nHA和micro-nBG粉末的存在能够在支架受压的过程中吸收一部分能量，起到增强支架的作用，当含量过高时粉体会发生团聚，这对支架的力学性能有负面影响8，9 。 图3.支架的力学性能与粉末含量的关系Fig.3 The relationship between the mechanical properties of the scaffolds and the content of powder4.3支架的矿化性能生物材料的体内活性可通过体外浸泡SBF过程磷灰石层形成情况定性判定10。四种支架显示了不同的矿化性能。图6展示了各支架在SBF中矿化21d后的表面形貌。实验结果显示，HA支架和HA/PCL支架表面均无磷灰石沉积，说明该两种支架生物活性较低；而HA/PCL-nHA复合支架表面有少量磷灰石沉积，说明生物活性较前两种支架有所提高。这是由于未烧结的nHA和烧结过的HA支架相比具有更好的生物活性；而HA/PCL-nBG复合支架表面有大量磷灰石生成，说明该复合支架具有较高的生物活性。这是由于45S5生物玻璃含有大量的Ca2+、Na+能够与溶液中的H+快速交换，在玻璃表面形成硅醇（Si-OH-），由于硅醇（Si-OH-）的形成和Si-O-Si键的破坏，会在表面形成多孔的SiO2凝胶层，Ca2+、CO32-、OH-以及PO43-离子等能在玻璃表面快速沉积形成类骨组织的磷灰石层，研究表明该磷灰石层具有优良的生物活性11,12。图4.支架在SBF中浸泡21d后的表面形貌扫描电镜照片Fig.4 SEM of scaffolds after immersed in SBF for 21d.4.4细胞实验结果各支架细胞实验结果如图 所示。由图所知，HA支架的Alarm Blue吸光值最高，这是由于HA具有良好的生物相容性；HA/PCL复合支架的Alarm Blue吸光值最低，这可能是由于PCL涂层为疏水性，对细胞的黏附有不利影响；而HA/PCLnHA和HA/PCLnBG两种复合支架的Alarm Blue吸光值要高于HA/PCL复合支架，低于HA支架，这可能是由于引入的PCL涂层抑制了HA支架基体的生物相容性而使复合支架不利于细胞黏附，而引入的nHA和nBG粉末具有良好的生物相容性，能够改善涂层的生物相容性，从而改善细胞对支架的黏附效果 13。图5.成骨细胞在支架上的增殖情况Fig.5 The proliferation condition of the Osteoblast on the scaffolds图是各支架上成骨细胞培养7d后的扫描电镜照片。从图中可以看出，支架上无细胞脱落，说明支架对细胞无毒副作用，由图所示，细胞在支架上伸展开，并向支架的孔洞生长，说明各支架生物相容性较好，有利于细胞的生长、繁殖以及后期的组织长入。图6. 支架表面成骨细胞形态：(a)HA支架；(b)HA/PCL复合支架；(c) HA/PCL-nBG复合支架；(d) HA/PCL-nHA复合支架.Fig.6 The cellular morphology of the Osteoblast on the scaffolds: (a)HAscaffold；(b)HA/PCL composite scaffold；(c) HA/PCL-nBG composite scaffold；(d) HA/PCL-nHA composite scaffold.5结论(1)采用糖球作为造孔剂可以制备出贯通性较好、孔结构分布较均匀的多孔HA陶瓷支架，支架孔隙率78%，最大抗压强度为0.64MPa；(2)支架涂覆过后孔隙率76%，满足骨组织工程要求，HA/PCL-nHA和HA/PCL-nBG复合支架抗压强度分别为1.98MPa和1.78MPa，较HA支架和HA/PCL支架有较大提高，且最大值在粉末含量为30wt%时取得；(3)在SBF中浸泡21d后，HA/PCL-nHA和HA/PCL-nBG复合支架表面均有磷灰石层生成，且HA/PCL-nBG复合支架有更多的磷灰石层生成，表明生物玻璃粉末较羟基磷灰石粉末具有更好的生物活性；(4)四种支架细胞实验结果显示，成骨细胞在各支架上均能正常增殖，说明支架具有良好的生物相容性。参考文献1 Hao Wang，Wei Zhi，Xiong Lu et al. Comparative studies on ectopic bone formation in porous hydroxyapatite scaffolds with complementary pore structures. Acta Biomaterialia 9，2013：8413-8421.2 Dehghani F, Annabi N. Engineering porous scaffolds using gas-based techniques. Curr.Opin. Biotechnol. 22(5)，2011：661-666.3 Luciana Goncalves Sicchieri，Grasiele Edilaine Crippa，Paulo Tambasco de Oliveira，et al. Pore size regulates cell and tissue interactions with PLGACaP scaffolds used for bone engineering. J Tissue Eng Regen Med6，2012：155-162.4 Guobao Wei，Peter X. Ma. Macroporous and nanofibrous polymer scaffolds and polymer/bone-like apatite composite scaffolds generated by sugar spheres.Inter Science，2005:306-315.5 J. Zhao, L.Y. Guo,