第二章 糖和苷-2(天然药物化学).ppt

第三节 糖和苷的理化性质 一 物理性质一 性状 形 苷类化合物多数是固体 其中糖基少的可以成结晶 糖基多的如皂苷 则多呈具有吸湿性的无定无形粉末 味 苷类一般是无味的 但也有很苦的和有甜味的 如甜菊苷 stevioside 是从甜叶菊的叶子中提取得到的 属于贝壳杉烷型四环二萜的多糖苷 比蔗糖甜300倍 临床上用于糖尿病患者作甜味剂用 无不良反应 色 苷类化合物的颜色是由苷元的性质决定的 糖部分没有颜色 二 溶解性 化合物糖苷化以后 由于糖的引入 结构中增加了亲水性的羟基 因而亲水性增强 苷类的亲水性与糖基的数目有密切的关系 往往随着糖基的增多而增大 大分子苷元的苷元 如甾醇等 的单糖苷常可溶解于低极性的有机溶剂 如果糖基增多 则苷元占的比例相应变小 亲水性增加 在水中的溶解度也就增加 因此 用不同极性的溶剂顺次提取药材时 在各提取部分都有发现苷类化合物的可能 碳苷与氧苷不同 无论在水中还是在其他溶剂中溶解度一般都较小 三 旋光性 多数苷类化合物呈左旋 但水解后 由于生成的糖常是右旋的 因而使混合物呈右旋 因此 比较水解前后旋光性的变化 也可以用以检识苷类化合物的存在 但必须注意 有些低聚糖或多糖的分子也都有类似的性质 因此一定要在水解产物中肯定苷元的有无 才能判断苷类的存在 二 化学性质 一 氧化反应 单糖分子中有醛 酮 醇羟基和邻二醇等结构 均可以与一定的氧化剂发生氧化反应 一般都无选择性 但过碘酸和四醋酸铅的选择性较高 一般只作用于邻二羟基上 以过碘酸氧化反应为例 1 过碘酸反应的基本方式 作用缓和 选择性高 限于同邻二醇 氨基醇 羟基醛 酮 邻二酮和某些活性次甲基上 基本反应如下 2 糖的裂解 3 作用机理 先生成五元环状酯的中间体 在酸性或碱性介质中 过碘酸以一价的H2IO5 水合离子 作用 结构式见书P73 上述机理可以解释在弱酸或中性介质中 顺式1 2 二元醇比反式的反应快得多 因为顺式结构有利于五元环中间体的形成 在连续有三个邻羟基的化合物中 如有一对顺式的邻羟基的 就比三上互为反式的容易氧化得多 故对同样的六碳吡喃糖苷 半乳糖和甘露糖苷的氧化速率比葡萄糖苷高 如书中P73结构A B C所示 另外 有些结构刚性较强 使得反式邻二醇固定在环的两侧而无扭转的可能 此时虽有邻二醇也不能发生过碘酸反应 因此 对阴性结果的判断应慎重 4 应用 对糖的结构的推测 如糖和苷中氧环的形式 碳原子的构型 多糖中糖的连接位置 和聚合度的决定 都有很大的用处 二 糠醛形成反应 单糖的浓酸 4 10N 作用下 失三分子水 生成具有呋喃环结构的糠醛类化合物 多糖则在矿酸存在下先水解成单糖 再脱水生成同样的产物 由五碳糖生成的是糠醛 R H 甲基五碳糖生成的是5 甲糠醛 R Me 六碳糖生成的是5 羟甲糠醛 R CH2OH 糠醛衍生物和许多芳胺 酚类可缩合成有色物质 可用于糖的显色和检出 如Molish试剂是浓硫酸和 萘酚 第四节 苷键的裂解 苷键的裂解反应是一类研究多糖和苷类化合物的重要反应 通过该反应 可以使苷键切断 从而更方便地了解苷元的结构 所连糖的种类和组成 苷元与糖的连接方式 糖与糖的连接方式 常用的方法有酸水解 碱水解 酶水解 氧化开裂等 一 酸催化水解 苷键属于缩醛结构 易为稀酸催化水解 反应一般在水或稀醇溶液中进行 常用的酸有HCl H2SO4 乙酸和甲酸等 反应的机理是 苷原子先质子化 然后断裂生成苷元和阳碳离子或半椅式的中间体 在水中溶剂化而成糖 以氧苷为例 其机理为 由上述机理可以看出 影响水解难易程度的关键因素在于苷键原子的质子化是否容易进行 有利于苷原子质子化的因素 就可使水解容易进行 主要包括两个方面的因素 1 苷原子上的电子云密度 2 苷原子的空间环境 具体到化合物的结构 则有以下规律 1 按苷键原子的不同 酸水解难易程度为 N 苷 O 苷 S 苷 C 苷原因 N最易接受质子 而C上无未共享电子对 不能质子化 2 呋喃糖苷较吡喃糖苷易水解 水解速率大50 100倍 原因 呋喃环平面性 各键重叠 张力大 图 3 酮糖较醛糖易水解 原因 酮糖多呋喃环结构 且端基上接大基团 CH2OH 图 4 吡喃糖苷中 吡喃环C5上的取代基越大越难水解 故有 五碳糖 甲基五碳糖 六碳糖 七碳糖 5位接 COOH的糖原因 吡喃环C5上的取代基对质子进攻有立体阻碍 5 2 去氧糖 2 羟基糖 2 氨基糖原因 2位羟基对苷原子的吸电子效应及2位氨基对质子的竞争性吸引 6 芳香属苷 如酚苷 因苷元部分有供电子结构 水解比脂肪属苷 如萜苷 甾苷等 容易得多 某些酚苷 如蒽醌苷 香豆素苷不用酸 只加热也可能水解 即芳香苷 脂肪苷原因 苷元的供电子效应使苷原子的电子云密度增大 7 苷元为小基团者 苷键横键的比苷键竖键的易于水解 因为横键上原子易于质子化 苷元为大基团者 苷键竖键的比苷键横键的易于水解 这是由于苷的不稳定性促使水解 原因 小苷元在竖键时 环对质子进攻有立体阻碍 8 N 苷易接受质子 但当N处于酰胺或嘧啶位置时 N 苷也难于用矿酸水解 原因 吸电子共轭效应 减小了N上的电子云密度 例 P78朱砂莲苷酰胺注意 对酸不稳定的苷元 为了防止水解引起皂元结构的改变 可用两相水解反应 例仙客来皂苷的水解P79 二 乙酰解反应 在多糖苷的结构研究中 为了确定糖与糖之间的连接位置 常应用乙酰解开裂一部分苷键 保留另一部分苷键 然后用薄层或气相色谱鉴定在水解产物中得到的乙酰化单糖和乙酰化低聚糖 反应用的试剂为乙酸酐与不同酸的混合液 常用的酸有硫酸 高氯酸或Lewis酸 如氯化锌 三氟化硼等 乙酰解的反应机理与酸催化水解相似 它是以CH3CO 为进攻基团 苷发生乙酰解的速度与糖苷键的位置有关 如果在苷键的邻位有可乙酰化的羟基 则由于电负性 可使乙酰解的速度减慢 从二糖的乙酰解速率可以看出 苷键的乙酰解一般以1 6苷键最易断裂 其次为1 4苷键和1 3苷键 而以1 2苷键最难开裂 下列为一种五糖苷的乙酰解过程 其分子组成中含有D 木糖 D 葡萄糖 D 鸡纳糖和D 葡萄糖 3 甲醚 当用醋酐 ZnCl2乙酰解后 TLC检出了单糖 四糖和三糖的乙酰化物 并与标准品对照进行鉴定 由此可推出苷分子中糖的连接方式 乙酰化反应的操作较为简单 条件较温和 一般可将苷类溶于醋酐或醋酐与冰醋酸的混合液中 加入3 一5 量的浓硫酸 在室温下放置1 10天 将反应液倒入冰水中 并以碳酸氢钠中和至pH3 4 再用氯仿萃取其中的乙酰化糖 然后通过柱色谱分离 就可获得单一的成分 这些单一成分再用TLC或GC进行鉴定 三 碱催化水解 一般的苷对碱是稳定的 不易被碱催化水解 故多数苷是采用稀酸水解 但是 酯苷 酚苷 氰苷 烯醇苷和 吸电子基取代的苷易为碱所水解 如藏红花苦苷 靛苷 蜀黍苷都都可为碱所水解 但有时得到的是脱水苷元 例如藏红花苦苷的水解 原因 其中藏红花苦苷苷键的邻位碳原子上有受吸电子基团活化的氢原子 当用碱水解时引起消除反应而生成双烯结构 四 酶催化水解 酶水解的优点 专属性高 条件温和 P83 用酶水解苷键可以获知苷键的构型 可以保持苷元的结构不变 还可以保留部分苷键得到次级苷或低聚糖 以便获知苷元和糖 糖和糖之间的连接方式 酶降解反应的效果取决于酶的纯度以及对酶的专一性的认识 例P83转化糖酶 水解 果糖苷键麦芽糖酶 水解 葡萄糖苷键杏仁苷酶 水解 葡萄糖苷键 专属性较低纤维素酶 水解 葡萄糖苷键目前使用的多为未提纯的混合酶 五 过碘酸裂解反应 用过碘酸氧化1 2 二元醇的反应可以用于苷键的水解 称为Smith裂解 是一种温和的水解方法 适用的情况 苷元结构不稳定 C 苷不适用的情况 苷元上也有1 2 二元醇反应的基本方法 应用于碳苷的情况 该反应的应用 苷元不稳定的苷 以及碳苷用此法进行水解 可得到完整的苷元 这对苷元的研究具有重要的意义 此外 从降解得到的多元醇 还可确定苷中糖的类型 如联有葡萄糖 甘露糖 半乳糖或果糖的C 苷经过降解后 其降解产物中有丙三醇 联有阿拉伯糖 木糖的C 苷经过降解后 其降解产物中有乙二醇 而联有鼠李糖 夫糖或鸡纳糖的C 苷经过降解后 其降解产物中应有丙二醇 第五节 糖的NMR特征 NMR技术的发展 使得苷类化合物的结构鉴定比较容易进行 糖和苷类化合物NMR谱解析的难点 1信号分布范围窄 2偶合关系复杂 一 糖的1HNMR特征 化学位移规律 端基质子 4 3 6 0ppm特点 比较容易辨认用途 1确定糖基的个数2确定糖基的种类32D NMR谱上糖信号的归属4糖的位置的判断 甲基质子 1 0ppm特点 比较容易辨认用途 1确定甲基五碳糖的个数2确定甲基五碳糖的种类3确定甲基五碳糖的位置42D NMR谱上甲基五碳糖信号的归属其余质子信号 3 2 4 2ppm特点 信号集中 难以解析归属 往往需借助2D NMR技术 偶合常数 与两面角有关两面角90度J 0Hz 两面角0或180度J 8Hz 两面角60度J 4Hz对于糖质子当2 H为直立键时 1位苷键的取向不同 1 H与2 H的两面角不同 偶合常数亦不同 D 和 L 型糖的1 H和2 H键为双直立键 180 J 6 8Hz D 和 L 型糖的1 H为平伏键 2 H双直立键 60 J 2 4Hz 因此 六碳醛糖的优势构象为C1型 其中C2构型与D 葡萄糖相同的D 半乳糖 D 阿洛糖的优势构象中2 H均为直立键 其成 苷键时 端基质子与2 H的偶合常数均为4Hz左右 而当其成 苷时 端基质子与2 H的偶合常数均为8Hz左右 例如 D 葡萄糖和 D 葡萄糖的混合物在氢谱上显示两个端基质子信号 不仅化学位移有差别 偶合常数差别也很明显 其中 D 葡萄糖的端基质子信号为 4 6 J 8Hz 而 D 葡萄糖的端基质子信号为 5 2 J 4Hz 但是当2 H为平伏键的情况下 1 H无论处于平伏键还是直立键 与2 H的两面夹角均约60度 故不能用该法判断苷键构型 因此 六碳醛糖中C2构型与葡萄糖不一致的D 甘露糖的苷键 就不能用端基质子的偶合常数来判断其构型 例如 D 甘露糖和 D 甘露糖的混合物在氢谱上虽显示两个端基质子信号 化学位移有差别 但偶合常数差别很不明显 同样 甲基五碳糖中的L 鼠李糖的C2构型虽与D 葡萄糖相同 但其优势构象为1C式 2 H为平伏键 其苷键的构型亦不能用该方法判断 对于这类糖的苷 可以利用糖苷的1 H的化学位移不同来区别 另外 用门控偶技术可以得到端基质子和端基碳的偶合常数 即1JC1 H1来区别 如吡喃糖苷的1 H是横键质子 苷键 时 该J值为170Hz 而1 H是竖键质子 苷键 时 该J值为160Hz 见教材P89 二 糖的13CNMR特征 糖上碳信号可分为几类 大致范围为 1 CH3 18ppm甲基五碳糖的C6 一般有几个信号 扣除苷元中的甲基 可表示有几个甲基五碳糖存在 2 CH2OH 62ppmC5或C63 CHOH70 85ppm糖氧环上的C2 C44 O CH O 98 100ppm端基C1或C2 在此范围内有几个信号可视为有几种糖存在于糖链的重复单位中 一般来说 碳原子上有 OH的较带 OH的 信号较在高场处 如具有C1构象的D 葡萄糖苷的端基碳信号 型的为97 101 而 型的为103 106ppm 便此可区别 和 异构体 三 苷化位移 概念 见教材 1 苷化位移值和苷元的结构有关 与糖的种类无关 2 苷元若为链状结构 端基碳的苷化位移随着苷元为伯 仲 叔基而递减 但对苷元的 碳和 碳的苷化位移影响不大 例如 同为葡萄糖的苷 苷元不同 其苷化位移范围 ppm 为 3 苷元为环醇时的苷化位移规律 教材P90 91 若羟基的 位无烷基取代 则 碳与端基碳的苷化位移值与开链的仲醇相似 如果羟基的 位有烷基取代 那么 碳和端基碳的苷化位移与苷元的 碳的手性及糖的端基手性都有关系 具体可分为两种情况 1 苷元的 碳的手性及糖的端基手性R或S 即二者相同 则 碳与端基碳的苷化位移值与 位无烷基取代的环醇时相同 即与开链的仲醇相似 即5ppm左右 2 苷元的 碳的手性及糖的端基手性不相同 则 碳与端基碳的苷化位移值比 位无烷基取代的环醇相应的碳的苷化位移大3 5ppm左右 即大约10ppm 3 同五异十其余七 4 同小异大 指 碳5 酯苷和酚苷 特殊 C向高场位移 第六节糖链结构的测定 多糖的结构测定与常见天然产物有许多不同之处 本节不做详细介绍 天然产物中的苷类成分多为固体化合物 其结构鉴定应通过以下各项程序进行 一 纯度的测定TLC 熔点 色谱鉴别二 分子量及分子式的测定近年来广泛应用质谱分析的方法则定分子量和分子式 苷类化合物一般极性较大 无挥发性 遇热气化时易于分解 采用电子轰击质谱 EI MS 常常不能获得分子离子峰 现多采用化学电离质谱 CI MS 场解吸质谱 FD MS 快原子轰击质谱 FAB MS 和电喷雾质谱 ESI MS 等方法来获得分子离子蜂 尤其是ESI MS及FAB MS两种质谱法更是目前测定苷类分子量常用的方法 电喷雾质谱 ESI MS 的基本原理 ESI是在毛细管的出口处施加一高电压 所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴 随着溶剂蒸发 液滴表面积缩小 导致分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相 电喷雾离子化的特点是产生多电荷离子而不是碎片离子 使质量电荷比降低到多数质量分析仪都可以检测的范围 因而大大扩张了分子量的分析范围 离子的真实分子量可以根据质荷比及所带电荷数计算出 一般由计算机软件完成 电喷雾质谱可忍受少量的盐和缓冲液 但盐和缓冲液的存在会使仪器的灵敏度降低 电喷雾质谱的优点是它可以方便地与多种分离技术联用 如液质联用和毛细管电泳 质谱联用等 三 组成苷的苷元和单糖的鉴定将苷用稀酸或酶进行水解 使生成苷元和各种单糖 然后再对这些水解产物进行签定 一 苷元的结构鉴定苷元的结构类型不一 需要通过某些化学反应先确定其结构类型和基本母核结构 再按照所属类型分别进行研究 其方法将在有关章节中逐一介绍 二 组成苷中糖的种类鉴定通常采用PC TLC等方法对水解液进行鉴定 也可以直接通过解析苷的或二维NMR谱进行鉴定 糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统 如正丁醇 醋酸 水 4 1 5 EtOAc 吡啶 水 2 1 2 等 其Rf值与溶剂的含水量有关 因此配制展开剂时必须注意 尤其对于三元组成的展开刑 其混合比例更应力求正确 并需用标准品同时点样作为对照 糖类的TLC常选用硅胶薄层 由于糖的极性强 一般点样量不能大于5ug 但这一缺点在用硼酸溶液或一些无机盐的水溶液代替水调制吸附剂进行铺板 就能显著提高上样量 并改善分离效果 制备这种硅胶薄层时 所用的盐一般是强碱弱酸 或中强酸 的盐 如0 3mol L的磷酸氢二钠或磷酸二氢钠的水溶液 用这种盐溶液制备的硅胶板分离糖时 其上样量可达400 500ug 糖类硅胶薄层色谱常用的展开剂为正丁醇 丙酮 水 正丁醇 醋酸 水或正丁醇 吡啶 水 糖的PC或TLC所用的显色剂有些是相同的 其显色原理主要是利用糖的还原性或由于形成糖醛后引起的呈色反应 有些显色剂不仅可以决定糖的斑点的位置 尚可区分其类型 常用的显色剂有苯胺 邻苯二甲酸试剂 三苯四氮盐试剂 TTC试剂 间苯二酚 盐酸试剂 双甲酮 磷酸试剂等 这些显色剂对不同的糖往往显不同的颜色 如苯胺 邻苯二甲酸试剂对已醛糖和糖醛酸显棕色 对戊醛糖显红色 间苯二酚 盐酸试剂对已醛糖显紫色 对糖醛酸和戊醛糖显蓝色 有些显色剂中含有硫酸 因此只能用于TLC 例如茴香醛 硫酸试剂 间苯二酚 硫酸试剂 萘酚 硫酸试剂 百里酚 硫酸试剂 酚 硫酸试剂等 喷后一般要在100 左右加热数分钟至斑点显现 以CMC Na为粘合剂的硅胶薄层 在使用含浓硫酸的显色剂时亦应注意加热的温度与时间 利用近年发展起来的二维NMR谱 也可以有效地鉴定苷分子中糖的种类 如二维1H 1H相关谱 1H 1HCOSY 1H 13C相关谱 1H 13CCOSY 等亦可用来鉴定苷中组成糖的种类 三 苷中糖的数目的测定利用PC或TLC法鉴定苷水解液中糖的种类 还可进一步采用光密度扫描法测定备单糖斑点的含量 算出各单糖的分子比 以推测组成苷的糖的数目 近年测定苷中糖的数目大多是通过光谱测定完成的 例如 利用质谱测定苷和苷元的分子量 然后计算其差值 并由此求出糖的数目 利用氢谱 根据出现的糖端基质子的信号数目来确定苷中糖分子的数目 或是将苷制成全乙酰化或全甲基化衍生物 根据在氢谱中出现的乙酰氧基或甲氧基信号的数目 推测出所含糖的数目 常见的是利用碳谱 根据出现的糖端基碳信号的数目 一般位于90 112ppm处 或者根据苷分子总的碳信号数目与苷元碳信号数目的差值 推断出糖的数目 此外利用二维1H 1H相关谱和1H 13C相关谱 也是确定苷中糖的数目的有效方法 四 苷分子中苷元和糖 糖和糖之间连接位置的确定 一 苷元和糖之间连接位置的确定以前通过分析由化学降解或酶解得到的产物来确定糖与苷元之间的连接位置 现在这种方法逐渐被NMR谱的解析所取代 13C NMR谱是确定苷元与糖之间连接位置的有效方法 在碳谱中 苷元羟基因与糖结合成苷 故可产生苷化位移 利用苷化位移规律 将苷和苷元的碳谱相比较 就可以很容易地辨别出苷元的哪个碳原子与糖相连接 近年二维NOE相关谱和远程同核 或异核 相关谱 如13C 1HCOSY及HMBC谱 等技术亦广泛用于确定苷元的连糖位置 二 糖与糖之间连接位置的确定可采用化学方法或光谱 NMR 分析法进行 1 化学方法部分水解法以缓和酸水解和酶水解法最为常用 缓和酸水解多使用低浓度的无机强酸或中强度的有机酸 如草酸 进行水解 可使苷中的部分糖水解脱去 例如 由于在水解产物中检出木糖 因此可以确定木糖连接在末端 利用苷的乙酰解 使开裂一部分苷键 保留另一部分苷键 分析水解产物中得到的乙酰化低聚糖 也可以确定糖的连接顺序 此外还可以将苷的全甲基化物进行甲醇解 然后分析其甲醇解产物 也可以获得有关糖与糖之间连接顺序的信息 一般方法是 先将苷进行全甲基化 然后用含6 9 盐酸的甲醇进行甲醇解 即可得到末完全甲醚化的各种单糖 而连接在最末端的一定是全甲醚化的单糖 根据这些甲醚化的单糖中羟基的位置 即可对糖与糖之间的连接位置作出判断 采用的方法通常是将这些甲醚化的单糖进行了TLC鉴定 并与标准品对照 近来亦有用GC MS联用仪对其进行鉴定的报道 全甲基化苷的甲醇解反应如下 上式中 苷通过全甲基化及甲醇解反应后 将甲醇解的产物进行TLC鉴定 可知除苷元以外 所得到的两种甲醚化单糖为2 3 4 三 O 甲基吡喃木糖甲苷和2 4 6 三 O 甲基吡喃葡萄糖甲苷 由于前者是全甲基化的木糖 因此可推断木糖是在末端 而后者是未完全甲醚化的葡萄糖 在其C3位上有一羟基 因此可推断它不仅与苷元相连 并在C3位上与木糖相连接 苷的甲基化反应 苷的甲基化反应常用的方法主要有以下四种 前两种为经典的方法 后两种是半微量的现代方法 1 Haworth法 用硫酸二甲酯和氢氧化钠 或碳酸钠 碳酸钾 可使醇羟基甲基化 其缺点是甲基化能力较弱 如果欲进行全甲基化反应 必须进行多次反应才能达到目的 2 Purdie法 用碘甲烷和氧化银为试剂 一般可在丙酮或四氢呋喃中进行 可使醇羟基甲基化 但因氧化银具有氧化作用 只能用于苷的甲基化 而不能用于还原糖的甲基化 3 Kuhn改良法 在二甲基甲酰胺 DMF 溶液中 加入碘甲烷和氧化银或硫酸二甲酯及氢氧比钡 或氧化钡 在搅拌下进行甲基化 本法的缺点是反应较缓慢 4 Hakomari法 箱守法 在二甲基亚砜 DMSO 溶液中 加入氢化钠 以碘甲烷进行甲基化反应 其反应机理是二甲亚砜与氢化钠首先生成甲基亚磺