仪器分析笔记 《可见-紫外光度分析法》.doc

第五章 可见-紫外分光光度法 基于物质分子对光的选择吸收而建立起来的分析方法 5.1 可见紫外分光光度法概述（了解）5.1.1 吸光光度法概述现代分析化学的“常规武器”1、分子光谱与原子光谱 吸收光谱 发射光谱 分子光谱 原子光谱 发射光谱 吸收光谱2、吸光光度法v 定义：分子光谱分析法的一种，又称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法，基于外层电子跃迁。v 分类： 目视比色法比色法 光电比色法(光电比色计)吸光光度法(分光光度法) 可见分光光度法 分光光度法 紫外分光光度法 红外吸收光谱法 v 特点：（与化学分析比较） a、灵敏（可测1%103%微量组分，甚至104%105% 微量组分)；b、准确度高（）；c、操作简便，快速（测微量）；d、应用广泛（无机、有机均可测）。表7-1-1 各类分析方法比较分析方法类别含量相对误差滴定分析法化学分析法1%0.1%0.2%重量分析法吸光光度法仪器分析法1%2%5%5.1.2 可见紫外吸收光谱法的特点及在石油化工方面的应用1、特点设备及操作简单，分析速度快，易普及推广应用；灵敏度高。特别适用测量低含量及微量组分，适宜测定的含量范围为0.001%0.1%；准确度高，相对误差一般为1%3%；应用范围广。能测定周期表中几乎所有金属元素，也能测定N、B、Si、As、O、S、Se、Te、F、Cl、Br、I等非金属元素，也能定量测定有机物，还可以用于测定平衡常数、配合物组成及分子量等物理化学常数；选择性好；谱带较宽，易与其他组分的光谱重叠引起光谱干扰，有时造成选择性不好；2、在石化工业中的应用比色法主要用于无机元素的测定；紫外吸收光谱法测定具有芳香结构的化合物及含有共轭体系的化合物5.2 可见紫外分光光度法的基本原理（理解）5.2.1 吸收光谱产生的原因1、单色光与复合光A、光的波粒二象性 光的折射 光的衍射 波动性 光的偏振 光的干涉光的波粒二象性 粒子性 光电效应 普朗克方程：式中：光子的能量（J，焦耳）；：光子的频率（Hz，赫兹）；：光子的波长（nm）；：光速（2.99791010cm.s-1）。 B、电磁波谱按照波长的长短顺序排列而成 可见光：400-750nm；近紫外：200-400nm；近红外：7502500nm。C、单色光、复合光与光的互补v 单色光：单一波长的光，通常意义的单色光是指波长处于很窄的某一范围的光；v 复合光：由不同波长的光组合而成的光。v 光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。2、物质对光的选择性吸收A、颜色与光的关系光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色。物质呈现的颜色与光有着密切的关系，物质呈现何种颜色，与光的组成和物质本身的结构有关。 物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础； 物质选择性地吸收白光中某种颜色的光，物质就会呈现其互补色光的颜色； 溶液颜色的深浅，取决于溶液中吸光物质浓度的高低。表5-2-1 光的互补关系3、吸收曲线（吸收光谱）吸光度（）与波长（）的关系曲线 吸收曲线中吸光度最大值处（吸收峰）对应的波长称为最大吸收波长，以表示。 定性分析基础：不同的物质具有不同的分子结构，因而具有不同的吸收曲线，可以根据吸收曲线的形状，即吸收峰的数目、峰对应的波长和最大吸收波长的位置，对物质进行定性分析。 定量分析基础：在同一波长下，物质的浓度越大，物质对光吸收程度越大。 同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状和的位置不变。4、分子吸收光谱A、光谱、吸收光谱及分子吸收光谱的概念白光经过棱镜而发生折射，各种光波的折射率（）随着波长而，可用科希经验公式表示：式中A、B、C：常数。因此，凡是按波长顺序排列的电磁辐射都可以称为光谱。如果让光源先通过吸光物质（溶液、液体或气体），再经过棱镜色散则所形成的光谱中就会出现一个至数个暗区或若干暗线，这就是该吸光物质的可见光吸收光谱，光谱中的暗区或暗线就是被吸光物质所吸收掉的光波区或光线。因此，把吸光物质对电磁辐射吸收时其透过的光谱称为吸收光谱。若吸光物质为分子或离子团，则称为分子吸收光谱；若吸光物质为原子蒸气，则称为原子吸收光谱。根据物质分子所吸收光的波长及能量的不同，可将分子吸收光谱区分为三类：可见紫外吸收光谱（200780nm）红外吸收光谱（0.7825m）远红外吸收光谱（251000m）B、分子吸收光谱的测定其测定方法是：利用棱镜的色散作用或光栅的衍射作用，从具有连续辐射的光源（如可见光用钨丝灯、紫外光用氢灯或氘灯、红外光用炽热的硅碳棒）中逐步分离出各个波长的光波，并使之一次通过吸收池中的被测物质溶液，测出溶液对每一波长的吸光度或透光度，绘制吸收光度波长曲线或透光度波长曲线。这种曲线就是吸收物质分子的吸收光谱，又称吸收光谱曲线或分光光度曲线。5.2.2 光的吸收定律（朗伯比尔定律）可见紫外光度分析法及红外吸收光谱法定量分析的理论基础（一）朗伯比尔定律及其意义1、吸光度的意义吸光度表示光束通过溶液时被吸收的程度，用A表示：式中：入射光强度；：透过光强度；：透光率。 溶液所吸收光的强度透过光的强度吸光度； 吸光度的范围：。2、透光度的意义透光度也称为透光率或透射比，表示透过光占入射光的比例，也是物质吸光程度的一种度量，以T表示：其中， 透光度的范围：；其对光的吸收，反之，其对光的吸收； 透光度也常以百分率表示，称为百分透射比100T，其值在0100之间。3、朗伯比尔（LambertBeer）定律朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比，即比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比，即两者结合起来，得到朗伯比尔定律：当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系，即：式中A：吸光度；：透射比；：溶液厚度；：溶液浓度；：比例系数，其与吸光物质的性质，温度，吸光波长有关。 LambertBeer定律使用条件：入射光为平行单色光且垂直照射；均匀非散射体系；吸光质点之间无相互作用（稀溶液，c0.01mol/L）；无荧光和光化学现象发生。4、比例系数的表示方法：吸收系数，单位为Lg1cm1c：g/L值的表示方法依赖于溶液浓度的表示方法，在液层厚度以厘米为单位时，比例系数的名称、数值及单位均随溶液浓度单位而变。常有以下三种表示方法： ：摩尔吸收系数，单位为Lmol1cm1c：mol/L：百分吸收系数未知分子量的物质a、摩尔吸收系数的意义表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时溶液的吸光度。单位： (Lmol-1 cm-1) 其与吸光物质的性质、入射光波长、温度和溶剂等因素有关；不同物质具有不同的，它是在一定条件下，某物质对某一波长的光的吸收能力大小的量度；对于同一物质，当其它条件一定时，的大小就取决于如射光的波长。即，因此； 是衡量光度法灵敏度高低的重要指标。该物质的灵敏度。一般认为，的方法是较灵敏的。b、与、与之间的关系式中：吸光物质的相对分子质量。5、吸光度的可加和原理多组分混合体系中，如果各组分分子之间不存在离解、聚合、化学反应等化学平衡时，其吸光度具有加合性，即： 根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定。 （二）LambertBeer定律发生偏离的原因Lambert定律是普遍成立的，而Beer定律却有时会偏离。偏离比尔定律的原因较多，基本是可分为物理和化学两个方面。物理方面主要是入射单色光不纯及杂散光等的影响；化学方面则是溶质的解离、缔合及互变异构反应等。1、单色光不纯的影响（仪器本身造成的）仪器使用的是连续光源，用单色器分光，由于单色器色散能力的限制和出口狭缝要保持一定的宽度，所以我们不可能得到纯的单色光。 非单色光引起的偏移： 复合光由和组成，对于浓度不同的溶液a和b，引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲，即用不纯单色光所测得的吸光度较用波长为所测得的吸光度小。 图5-2-2 对比尔定律的偏离 图5-2-3 不纯单色光的影响 克服方法： A、尽量选用较好的单色器，使入射光的波长范围尽可能窄； B、入射波长选择在峰值位置（在波峰有一个A值相差较小的区域）；2、非平行入射光 导致光束的平均光程b大于吸收池厚度b，实际测得的吸光度大于理论值，产生正偏离。3、介质不均匀入射光会因散射而损失，导致T减小，实测的A偏高。 克服方法：避免溶液产生胶体或浑浊。4、化学因素吸光物质常因稀释、pH值及试剂浓度变化等因素的影响而发生一系列化学反应，例如离解、缔合、溶剂化、互变异构反应及吸光物质组成改变等，结果使溶液中吸光物质的真实浓度与溶液的指示浓度不再成正比关系，破坏了吸光度与浓度的线性关系，于是偏离了光吸收定律。如：Cr2O72+H2O2HCrO42H+2CrO42 PAR的偶氮醌腙式 5、最佳的吸光度测量范围5.2.3 可见紫外吸收光谱的产生及分子结构的关系1、分子的能级与吸收光谱的产生A、物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动；（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。l 分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级l 三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量l 分子的内能：电子能量Ee 、振动能量Ev 、转动能量Er 即 EEe+Ev+Er evr 分子的这三种能级分布情况如下图示。B、能级跃迁紫外可见光谱属于电子跃迁光谱。 电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 讨论：（1）转动能级间的能量差Er：0.0050.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；（2）振动能级的能量差Ev约为：0.05eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱； （3）电子能级的能量差Ee较大120eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外可见光区，紫外可见光谱或分子的电子光谱；（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据；（5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数max也作为定性的依据。不同物质的max有时可能相同，但max不一定相同；（6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。2、可见紫外吸收光谱的主要类型跃迁引起的吸收谱带；跃迁引起的吸收谱带；跃迁引起的吸收谱带；跃迁引起的吸收谱带；电荷转移引起的吸收谱带（跃迁）；配位体场跃迁引起的吸收谱带（，跃迁）。3、基本概念A、生色团最有用的紫外可见光谱是由和n跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基NN、乙炔基、腈基CN等。B、助色团：有一些含有n电子（孤对电子）的基团(如OH、OR、NH2、NHR、X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。 C、红移与蓝移有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长max和吸收强度发生变化： max向长波方向移动称为红移，或长移。向短波方向移动称为蓝移 (或紫移)或短移。 吸收强度即摩尔吸光系数增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如图所示。强带(strong band)：emax104弱带(weak band)：emax103 溶剂极性的不同也会引起化合物吸收光谱的红移或蓝移，这种作用称为溶剂效应：在跃迁中，激发态极性大于基态，当使用极性大的溶剂时，由于溶剂与溶质相互作用，激发态比基态的能量下降得更多，因而激发态与基态之间的能量差减小，导致吸收谱带max红移。而在跃迁中，基态n电子与极性溶剂形成氢键，降低了基态能量，使激发态与基态之间的能量差变大，导致吸收带max向短波区蓝移。4、吸收带吸收峰在紫外可见光谱中的波带位置A、R带从德文Radikal(基团)得名 为n*跃迁引起的吸收带。如羰基C=O、NO2、CHO等，其特点为吸收强度弱，100，吸收峰波长一般在270nm以上；B、K带从德文Konjugation(共轭作用)得名 为*跃迁引起的，如共轭双键。该吸收带的特点为吸收峰很强，104，最大吸收峰位置一般在217280nm。共轭双键增加，max向长波方向移动，max也随之增加；C、B带从德文Benzenoid(苯的)得名 为芳香化合物(包括杂环芳香化合物)的特征吸收带。这是由于*跃迁和苯环的振动重叠引起的。苯蒸气在230270nm处出现精细结构的吸收光谱，称为笨的多重吸收带或精细结构吸收带。在极性溶剂中或苯环上有取代基时，复杂的B吸收带简化，精细结构消失，出现一宽峰，中心在256nm，220。D、E带 是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭系统的跃迁所产生的。分为E1和E2吸收带，其中E1在185nm 附近，=47000，E2在204nm，=7900，均为强吸收。5、有机化合物的紫外可见吸收光谱有机化合物的紫外可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：电子、电子、n电子(p电子)。分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。 外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量大小顺序为：nn跃迁所需能量最大，电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区（吸收波长200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到）。如甲烷的为125nm，乙烷max为135nm。n跃迁 所需能量较大。吸收波长为150250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n *跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n *跃迁的分别为173nm、183nm和227nm。跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，摩尔吸光系数max一般在104Lmol1cm1以上，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如：乙烯*跃迁的为162 nm，max为：1104 L mol-1cm1。n 跃迁需能量最低，吸收波长200nm。这类跃迁在跃迁选律上属于禁阻跃迁，摩尔吸光系数一般为10100 Lmol-1 cm-1，吸收谱带强度较弱。含有杂原子不饱和基团如=C=O、=C=S、-N=N-等，分子中孤对电子和键同时存在时发生n 跃迁。丙酮n 跃迁的为275nm max为22 Lmol-1 cm -1（溶剂环己烷)。 6、金属配合物的紫外可见吸收光谱金属离子与配位体反应生成配合物的颜色一般不同于游离金属离子(水合离子)和配位体本身的颜色。金属配合物的生色机理主要有三种类型：配位体微扰的金属离子dd电子跃迁和ff电子跃迁 摩尔吸收系数很小，对定量分析意义不大。 金属离子微扰的配位体内电子跃迁 金属离子的微扰，将引起配位体吸收波长和强度的变化。变化与成键性质有关，若静电引力结合，变化一般很小。若共价键和配位键结合，则变化非常明显。 电荷转移吸收光谱 在分光光度法中具有重要意义。a、当吸收紫外可见辐射后，分子中原定域在金属M轨道上电荷的转移到配位体L的轨道，或按相反方向转移，这种跃迁称为电荷转移跃迁，所产生的吸收光谱称为荷移光谱。b、电荷转移跃迁本质上属于分子内氧化还原反应，因此呈现荷移光谱的必要条件是构成分子的二组分，一个为电子给予体，另一个应为电子接受体。c、电荷转移跃迁在跃迁选律上属于允许跃迁，其摩尔吸光系数一般都较大(10 4左右)，适宜于微量金属的检出和测定。d、电荷转移跃迁在紫外区或可见光呈现荷移光谱，荷移光谱的最大吸收波长及吸收强度与电荷转移的难易程度有关。 例：Fe3与SCN形成血红色配合物，在490nm处有强吸收峰。其实质是发生了如下反应：Fe3SCN hFe SCN 2 5.3 可见紫外分光光度法的应用（掌握）紫外可见分光光度法主要用于有机物分析。定性分析：比较吸收光谱特征可以对纯物质进行鉴定及杂质检查；定量分析：利用光吸收定律进行分析。 5.3.1 定性分析1、紫外可见分光光度法定性分析的内容包括化合物的鉴定及结构分析两方面。2、一般有两种定性方法：比较吸收光谱曲线；用经验规则计算最大吸收波长，然后与实测值比较。（一）化合物的鉴定1、比较光谱的一致性在相同的测定条件下（溶剂、pH等）下，测定未知物的吸收光谱与所推断化合物的标准物的吸收光谱直接比较，或将其与未知物的吸收光谱数据进行比较。如果吸收光谱的性状，包括吸收光谱的、吸收峰数目、位置、拐点及等完全一致时，则可初步认为是同一化合物。为了进一步确定，可再用其他溶剂分别测定，如吸收光谱仍然一致，则进一步肯定二者为同一物质。 应指出，紫外吸收光谱相同，有时两种化合物不一定相同，因为紫外吸收光谱通常只有23个较宽的吸收峰，具有相同生色团而结构不同的分子，有时会产生相同的紫外吸收光谱。因此，不能单凭紫外吸收光谱下结论。2、比较最大吸收波长及吸光度比值的一致性若物质的吸收峰较多，往往规定以某几个吸收峰对应的吸光度或吸收系数的比值作为鉴定标准。将试样与标准样品或与文献数据相比较，最大吸收波长相同，峰处吸光度或吸收系数的比值在规定范围内，则可认为两者是同一物质。 纯度检查1、杂质检查：有杂质时，吸收光谱变形。2、杂质限量检查：以某一波长吸光度值表示； 以峰谷吸光度比值表示。 （二）结构分析可见紫外吸收光谱基本上是分子中生色团和助色团的特征，而不是整个分子的特征。因此，在结构分析中，可见紫外吸收光谱法的主要作用是推测官能团及确定共轭体系，如羰基、硝基、苯环、共轭二烯及共轭多烯等。1、官能团的鉴定初步判断规律：（1）化合物在220280nm范围内透明（即），可推断化合物不含苯环、共轭双键、醛基、硝基、酮基、溴和碘；（2）在210250nm有强吸收带，表示含有共轭双键。如范围内，说明为二烯或不饱和酮；如在260、300、330nm有高强度吸收峰，则化合物含有35个共轭键；（3）在250300nm有弱吸收带，则含有羰基；在此区域若有中强吸收带，则是苯核的特征；（4）如化合物有许多吸收峰，甚至延伸到可见光区，则可能为一长链共轭化合物或多环芳烃。2、顺反异构体的确定一般来说，反式异构体比顺式异构体有较大的及，据此可以判别顺反异构体。3、互变异构体的确定常见的互变异构体有酮烯醇式、醇醛的环式链式、酰胺的内酰胺内酰亚胺式等。例如，乙酰乙酸乙酯具有酮烯醇式互变异构体： 酮式 272nm（），R带 烯醇式 300nm，R带 243nm，E带 这两种异构的相对含量随溶剂的极性而变，在极性溶剂中，例如在水中，酮式易与极性溶剂形成氢键，上述平衡左移，使酮式占优势，其吸收光谱只有1个弱峰R带；在非极性溶剂中，例如在己烷中，烯醇式可生成分子内氢键而具有稳定性，使烯醇式占绝对优势，其吸收光谱除有一个弱吸收带R带外，在243nm处还有一个强吸收带K带。4、将经验规则计算的与实测值对照确定化合物结构（1）共轭烯烃的计算Woodward总结了大量实验数据，提出了共轭二烯、三烯、四烯K吸收带的计算规则，如下表，以溶剂为乙醇基数（共轭二烯基本吸收带）增加值217nm5、助色团OCOR0nm1、二烯在同一环内（同环二烯）36nmOR6nm2、每个烷基（或环基）5nmSR30nm3、环外双键5nmCl，Br5nm4、增加一个共轭双键30nmNR1R260nm环外双键是指某一环内的环外并与该环直接相连的双键。例1：水芹烯有两种异构体，经其他方法测定其结构为A及B。其紫外光谱：体的max为263 nm (max为2500)，体的max为231 nm (max为900) 。试问A及B何者为体，何者为体？ （A） （B）解：根据Woodward规则计算出（A）及（B）两结构的：（A） （B）基值 217nm 217nm 烷基 （52）+10 nm （53）+15 nm环外双键 （51）+5 nm 0nm同环二烯 0nm 36nm 由以上计算可知：结构（A）的计算值（），与体的实测值（231nm）相近，故结构（A）应为体，而结构（B）为体。（2），不饱和醛、酮、酸、酯的计算由于Woodward、Fieser及Scott等人的工作，总结出了计算，不饱和醛、酮、酸、酯K吸收带的计算规则，如下表，以溶剂为乙醇基值OAC6nm、不饱和醛207nmOR35nm、不饱和酮215nm30nm、不饱和六元环酮215nm17nm、不饱和五元环酮202nm31nm、不饱和酸或酯SR85nm或单取代208nmCl15nm、或、双取代217nm12nm、三取代225nmBr25nm增加值30nm增加1个共轭双键（对酸、酯也适用）30nmNR1R295nm烷基或环基 10nm每个环外双键（对酸、酯也适用）5nm12nm或更高（对酸、酯也适用）18nmOH 35nm30nm50nm例2：计算该物质的。解： 、双取代不饱和酯 217nm 环外双键 +5 nm (计算值)=222nm（3）羰基取代苯化合物RC6H5COX的计算Scott规则如下表，以溶剂为乙醇。该规则用于计算羰基取代苯化合物中苯环与羰基共轭所形成的K吸收带的值。例3：计算下述化合物的值。解： 酸基值 230nm对位NH2 +58nm(计算值)=288nm实测值=288nm5.3.2 定量分析定量分析的方法很多，应根据测定对象和目的加以选择。单组分常规定量法；高浓度或极低浓度差示分光光度法；试样浑浊或背景吸收较大双波长分光光度法。（一）常规定量法1、比较法比较法又称为标准对照法。在最大吸收波长处分别测出试样溶液及标准溶液的吸光度及，进行比较可直接求得样品的浓度。 2、标准曲线法应用最广泛配制一系列（一般为58个）浓度不同的标准溶液分别在选定波长下测定其吸光度绘制工作曲线（若符合吸光定律，则可得到一条通过坐标原点的直线）相同条件下测样液的吸光度在标准工作曲线上查出其对应的浓度 本法特点：分析同种类的大批试样比较方便。因为这样一条标准曲线，只要操作条件不变，就可供一段时间内使用，不必每做一个试样分析都要同时作一条标准曲线。 注意事项：标准溶液的组成与浓度应尽量与试样接近；如仪器条件和操作条件（试剂、酸度、温度）变化了，则应校正曲线，或重新制作标准曲线。3、标准加入法（增量法）分类：一次标准加入法和多次标准加入法。（1）一次标准加入法取一份试液测其吸光度，设为，再取另一等分试液，加入一定量标准溶液使其浓度增加，测定吸光度，设为，根据LambertBeer定律得： （2）多次标准加入法该法是在若干等份试样溶液中分别加入不同量的被测组分标准溶液，使增量值分别为0，测定对应的吸光度，则绘制校正曲线，如下图，用外推法使校正曲线延长于横坐标点，则的长度所对应的浓度就是被测组分的。除被测组分含量不同外，在各分试样中其他成分都相同，他们对一系列吸光度测定的影响都一致，能相互抵消。因此，标准加入法特别适合复杂试样中微量组分的测定。（二）多组分定量方法以两组分为例根据吸光度的加和性特点，在同一试样中可以测定两个以上的组分。设试样中含有，两种组分，在一定条件下将他们转化为有色化合物，分别绘制其吸收光谱，会下图出现三种情况：（1）图情况是，组分互不干扰，各在处测定；（2）图情况是干扰组分测定，但对无干扰；此时可先在处测量溶液的吸光度，并求得组分的浓度；然后再在处测量溶液的吸光度和纯组分及的和，根据吸光度的加和性特点，列出下式：即能求出组分的浓度。（3）图情况是，组分互相干扰，这时首先在处测量混合物的吸光度和纯组分及的和值。然后在处测量混合物的吸光度和纯组分及的和值。列出方程式：式中、和、：由浓度及的纯溶液测得；、：由实验测得；、：联立方程求得。 对于更复杂的多组分体系，可用计算机处理测定的结果； 理论上，该法可应用于多组分体系的测定，但实际应用较少，原因是误差较大。（三）差示分光光度法1、方法原理该法的特点是用一个已知浓度的标准溶液作为参比溶液以测量吸光度。根据光吸收定律对未知溶液有： 对浓度为的标准溶液有： 以浓度为的标准溶液作为参比溶液时，所测得未知溶液的吸光度为式中：相对吸光度。上式表明，它是差示分光光度法的基本公式。2、测定方法（1）高吸光度测定法其操作方法是在检测器未受光照射时，调节仪器的透光度为0；当入射光通过一个比试样浓度稍低的参比溶液时，将仪器的透光度调为100%，如下图示：然后测定试样的吸光度，用比较法或标准曲线法确定试样浓度。绘制标准曲线的方法是：根据试样浓度大小，配制一系列标准溶液以浓度最小（）的一个溶液作为参比溶液测定其他标准溶液的相对吸光度绘制标准曲线也可用比较法计算未知溶液的浓度。由对未知溶液及标准溶液得： （2）低吸光度测定法此法要求参比溶液的浓度大于试样溶液的浓度。具体操作方法如下：用纯溶剂调仪器的透光度为100%再用参比溶液来调仪器的透光度为0测定试样的相对吸光度同样地，也可以用标准曲线法或比较法来求试液的浓度。标准曲线法：作图；比较法：（3）最精确测定法此法要用两个浓度不同的标准溶液作为参比溶液，并要求试样浓度介于两个参比溶液之间。先用一个比试样浓度大的参比溶液调节透光度为0，再用一个比试样浓度小的参比溶液调节透光度为100%。该法也可用标准曲线法及比较法来计算未知液的浓度。 差示分光光度法实际上就是把读数标尺对测量有用的一段加以扩展放大，所以，能提高分析结果的准确度； 差示法在实际应用中收到一定限制，因为使用一定浓度的标准溶液作为参比溶液时，透射光强度减弱，为了调100%透光度，就必须提高光源强度、增宽狭缝或提高仪器的灵敏度。增宽狭缝和提高仪器灵敏度又会使光谱通带变宽，噪音增大，造成测定灵敏度下降和工作曲线的线性关系破坏。（四）双波长分光光度法1、基本原理让波长为及的两束单色光分别交替地通过同一试液，若调节两单色光的入射强度均为，则试液对两波长的吸光度分别为式中、：单色光及的透过光强度；、：被测物质在及波长下的摩尔吸收系数；、：试样溶液对及两单色光的背景吸收。若设法使，则上述两式之差为：上式表明，这是双波长分光光度法的理论基础。 与单波长分光光度法相比，双波长分光光度法的特点是不用参比溶液，而试液本身对某一波长的吸光度作为参比，这可避免单波长分光光度法使用试样及参比两个吸收池时由于两吸收池之间的差异所引起的误差，可以消除背景吸收及光散射所引起的误差，适用于多组分混合物的分析。2、波长组合的选择选择波长组合的基本条件是：被测组分在两波长处的吸光度及其差值应足够大；共存（干扰）组分在两波长下应具有相同的吸收，因此可将干扰组分的吸光度视为背景吸收而加以扣除。选择组合的方法，通常用作图法，现在以两组分混合物为例加以说明：（1）曲线是欲测组分A的吸收光谱，曲线b是干扰组分B的吸收光谱。（2）可选择A组分的最大吸收波长作为测定波长，然后沿此作一垂直于X轴的垂线，此垂线交曲线b于D点，由D点作X轴的平行线，在曲线b上便有1个或几个交点（如图E、F），这些交点所对应的任一波长都可以选作参比波长，但究竟选择哪一个更好，就要考虑波长组合的基本条件。定量分析方法也可用标准曲线法或比较法。5.3.3 可见紫外分光光度法的应用（一）配合物组成及其稳定常数的测定1、摩尔比法（饱和法） 根据金属离子M与配体R反应过程中被饱和原则来测定配合物组成设配位反应：M + nRMRn(有色）前提：M、R均无色，即M和R均不干扰MRn；MRn稳定；n值大。固定，改变，配制一系列不同的溶液，在处分别测量各溶液的吸光度A，作图。图5-3-1 配合物组成的测定（1）当加入的配位体R还没使M定量转化为MRn时，曲线处于直线阶段；（2）当加入的配位体R已使M定量转化为MRn并稍有过量时，曲线便出现转折；（3）加入的R继续过量，曲线便成水平直线；（4）转折点所对应的摩尔比便是配合物的组成比。若配合物稳定，则转折点明显；反之，则不明显，此时可用外推法求得两直线的交点。配合物的稳定常数表示为：设配合物不离解时在转折点处的浓度为，配合物的解离度为，则达到平衡时则 式中。在转折点处可求得，吸光度A可由实验测得，由外推法求得，则： 摩尔比法适用于解离度小、稳定性高、配位比高的配合物组成的测定。 2、等摩尔连续变化法（Job法）设配位反应：M + nRMRn(有色）保持为常数，连续改变，配制一系列显色溶液，分别测量系列溶液的吸光度A，以A对作图。 若以M、R和MRn分别表示金属离子、配位体和配合物平衡时的浓度，f为金属离子在总浓度中所占的分数，则 等摩尔连续变化法适用于配位比低、稳定性较高的配合物组成的测定。 （二）酸碱解离常数的测定光度法是测定分析化学中应用的指示剂或显色剂解离常数的常用方法，因为它们大多是有机弱酸或弱碱，只要它们的酸色形和碱色形的吸收曲线不重叠。该法特别适用于溶解度较小的弱酸或弱碱。现以一元弱酸HL为例，在溶液中存在平衡：HLH+L其解离常数由上式可知，只要在某一确定的pH条件下，知道值，就可以计算出。HL与L互为共轭酸碱，它们的平衡浓度之和等于弱酸HL的分析浓度c。只要两者都遵循LambertBeer定律，就可以通过测定溶液的吸光度求得值。具体做法如下：配制个浓度相同而pH不同的HL溶液在某一确定波长下，用1.0cm的吸收池测量个溶液的吸光度A酸度计测量各溶液的pH值各溶液的吸光度为： （a）在高酸度介质中，可以认为溶液中该酸只有HL型体存在，仍在上述确定的波长下测定吸光度，则 （b）在碱性介质中，可以认为该酸主要以L型体存在，则 （c）将（b）、（c）代入（a）后，整理得：或 上述是光度法测定一元弱酸解离常数的基本关系式。式中、分别为弱酸定量地以HL、L型体存在时溶液的吸光度，该两值是不变的。A为某一确定pH时溶液的吸光度。上述各值均可由实验测得。将测得的数值代入上式，则可算出值。对于一系列（n个）c相同而pH不同的HL溶液，就可测得n个值，然后取其平均值。5.4 可见紫外分光光度计（掌握）5.4.1 基本组成部分及其结构原理1、紫外可见分光光度计的组件2、光学性能5.4.2 紫外可见分光光度计的类型1、单光束分光光度计简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。2、双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。3、双波长将不同波长的两束单色光(1、2) 快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。两波长同时扫描即可获得导数光谱。5.5 分析条件的选择（掌握）5.5.1 仪器测量条件1、浓度测量的相对误差与溶液透射比的关系任何分光光度计都有一定的测量误差，这是由于光源不稳定，实验条件的偶然变动、读数不准确等因素引起的。这些因素对于试样的测定结果影响较大，特别是当试样浓度较大或较小时。因此要选择适宜的吸光度范围，以使测量结果的误差尽可能减小。根据LambertBeer定律可知：微分得：再将上式代入LambertBeer定律得，测定结果的相对误差为：要使测定结果的相对误差最小，对求导数应有极小值，即解得或，即当时，吸光度测量误差最小。如果光度计读数误差为1%，若要求浓度测量的相对误差小于5%，则待测溶液的透射比应选在70%10%范围内，吸光度为0.151.00。实际工作中，可通过调节待测溶液的浓度，选用适当厚度的吸收池等方式使透射比或吸光度A落入此区间。2、入射光波长和狭缝宽度的选择测定波长的选择：吸收最大的波长为入射光，干扰最小；狭缝宽度的选择：试样吸收峰半宽度的。5.5.2 反应条件的选择本节内容主要涉及显色反应一节内容，将在5.6 显色反应与显色剂一节中详述。5.5.3 参比溶液的选择测量试样溶液的吸光度时，先用参比溶液调节透射比为100%，若选择不适当，对测量读数的影响较大。主要是消除溶液中其他组分对光的吸收等带来的影响。1、溶剂参比液 当试液、