用液体石蜡保存菌种的新方法.doc

用液体石蜡保存菌种的新方法关键词:菌种保存;液体石蜡2 保存菌种的效果 见表 to 在临床细菌学工作中，常将液体石蜡加于高层琼脂表面或半固体琼脂斜面，以延长细菌的生命。有鉴于此，笔者尝 表 1三种方法保存菌种的效果试了几种保存菌种的新方法，现简介如下。存活时间(4)方法 菌种举例1 方法金黄色葡萄球菌普通变形杆菌 6个月以上琼脂切块法1. 1 琼脂切块保存法 取12 mm x 100 mm试管数支，每管 福氏志贺菌 伤寒沙门菌 3个月以上加液体石蜡(医用或化学纯)约2 ml，试管口加上透气塞干烤 同上 2个月以上 挖沟“孤岛”法(150x 1 h)灭菌，待冷后换上消毒的(100煮15 min)胶 福氏志贺菌 伤寒沙门菌 2个月以上微量生化鉴定管法塞，置4冰箱备用。 用接种环将待保存的细菌菌落连同局部的琼脂(普通琼3 讨论脂培养基)切割成约8 mm x 8 mm x 8 mm的小块，置于上述 上述三法都只适用于临时性的保存菌种，主要优点是便试管中，菌落面勿贴管壁。盖紧胶塞，置4冰箱保存。捷。市售化学纯液体石蜡是无色油状混合物，冷凝点在1.2 挖沟“孤岛”保存法 在分离培养之可疑菌落局部或纯一17.7一4.4之间。笔者采用的是武汉江北化学试剂培养(普通琼脂培养基)菌苔局部或“药敏”平板(M-H琼脂厂的产品(批号:916023等)，在一5环境中不结冰。将普培养基)菌苔局部的外周挖沟，以形成“孤岛”，然后将灭菌通变形杆菌、金黄色葡萄球菌用琼脂切块法保存于这一环境液体石蜡注满小沟并覆盖至“孤岛”之菌落表面上，盖上皿中，维持活力分别在12个月以上及10个月以上。若液体石盖，不可倒置，放4冰箱保存。蜡结冰，细菌便很快死亡。1.3 微量生化鉴定管保存法 用无菌毛细吸管取无菌液体 (收稿日期:2004-12-28，修回日期:2005-05-23石蜡，插人到微量细菌生化鉴定管(已报告结果)，在近液面 (本文编辑:杨林)处加液体石蜡，边加边外移毛细吸管。再轻甩以排出管中之气泡，置4冰箱保存。临床检验杂志2005年第23卷第5期贴壁细胞在载玻片上爬片的新方法.中国应用生理学杂志,2009,25(2):283-284.贴壁细胞在载玻片爬片的新方法徐 洪1，宋旭东1，李 莹2，代 健1（1华北煤炭医学院 病理学教研室，2血液内科教研室，河北 唐山 063000）摘 要目的：对传统细胞爬片方法进行改良。方法：利用1ml蓝枪头和载玻片制作，在载玻片上种植细胞制成细胞爬片，进行后续染色。结果：细胞直接爬于载玻片上，未发现细胞污染和增殖受限。与传统爬片相比细胞脱落少。结论：与传统爬片染色方法相比具有用材简单、价格低廉、爬片效果好、操作方便等优点。关键词：细胞爬片；细胞培养中图分类号：R36 文献标识码：A 文章编号：1000-6834（2009）01-The New Method of Cells Growing on the Glass SlideXu Hong1 , Song Xudong 1, Li ying2 , Dai Jian1( 1. Department of pathology , North China Coal Medical University , 2. Department of BloodInternal Medicine, Heibei province , Tangshan 063000 , China )ABSTRACTAim : To improved the method of cell growing on the slide . Methods : Cells were planted in a system making by 1 ml tips and slide . Result : Cells grow on the slide directly , no pollution and well proliferation , was fewer dropped off the slide than the traditionary method . Conclusion : The improved method had the advantages including easy-material , low-price , well-effect and convenient-operation , prior to the traditionary method .KEY : cell growing on the glass slide ; cell culture 在细胞培养中观察细胞形态时，除了使用倒置相差显微镜以外，还需要进行普通或者特殊染色，这时候就需要制作细胞爬片。常规的制作贴壁细胞爬片的方法，经常是在装有盖玻片或专用细胞爬片上种植爬片，在染色过程中操作起来比较繁琐。经过多次实践，对传统爬片方法进行改良，研究了一种在载玻片上直接进行爬片的方法，与市售Lab-Tek腔室玻片原理相同，现介绍如下。1 材料与方法11 材料 普通载玻片和1ml tips若干。细胞：Eca-109食管癌细胞株（华北煤炭医学院中心实验室保存）。 12 方法 取1000l tips若干，在其尾端剪下12mm长的筒管一个，重复制作得到若干筒管备用。2）将得到的筒管用适量中性树胶粘贴到载玻片上，方向为原tips尾端（直径为8mm）朝下，断端朝上，在载玻片中下2/3的位置，成对称双行排列，同时粘贴4-6个筒管（见图1）。中上1/3位置为书写标记区域。干燥固定后放入饭盒内进行高压灭菌消毒。超净台内制备细胞悬液，每孔放置细胞悬液400 ul。置入无菌饭盒中，放入37、5%CO2饱和湿度培养箱孵育24h或按照实验设计的时间孵育。待细胞贴壁后去除筒管，用4%多聚甲醛将载玻片固定30分钟。HE染色，镜下观察。同时用传统方法进行爬片，镜下观察并比较。2 结果用此种方法爬片，细胞直接爬于载玻片上，未发现细胞污染和增殖受限，细胞生长状态良好、分布均匀，无明显脱片现象（图2）。图3为传统爬片，可见部分细胞脱落。与传统爬片方法相比，具有用材简单、价格低廉、爬片效果好、操作方便等优点。3 讨论在实验过程中，根据细胞爬片的基本原理，通过实际操作，摸索并总结经验，对传统的爬片模式进行了改良。对于贴壁细胞来讲，提供一个合适的培养环境即可在平面（玻璃、塑料等）上贴壁生长。细胞如果能在盖玻片上贴壁生长，在载玻片上也一样可以贴壁生长的。与传统爬片方式相比，该改良方法有如下优点：1）用材简便、价格低廉。载玻片、tips、中性树胶都是实验室常用的耗材，不需要购买相应的24孔板或6孔板，同时也不需要购买专用的细胞爬片。24孔板的直径16mm，底面积201.06mm2，实际爬片面积与放入其内的裁切好的盖玻片有关，一般为96mm2；而改良方法爬片面积与筒管直径有关，一般1ml枪头直径为8mm，爬片面积为50.27mm2。24孔板需要培养基1000l/孔，密度为21043104/孔；而改良方法400l/孔，密度为51038103/孔。比较起来，改良方法耗费的培养基和细胞都要比传统爬片方法要节省的多。2）爬片效果更好。实验中我们发现盖玻片爬片时，周边爬片效果良好，而中间位置容易出现不明原因的严重脱片现象，甚至出现盖玻片两面都贴上细胞的情况。改良后，细胞分布均匀，没有明显的脱片情况。3）操作简便。细胞在载玻片爬片最大的优点就是能够大批量的进行染色，如同普通石蜡切片一样。有研究人员用明胶1或者玻璃胶2将盖玻片爬片粘到载玻片上进行染色，或用琼脂糖包埋后进行石蜡包埋3后切片染色，这些都是变盖玻片爬片为载玻片爬片的方法，有利于后续染色的简便。传统爬片需要裁切与孔板相适宜的盖玻片或购买专用细胞爬片，在取出爬片时，经常会损坏爬片。在透明过程中，如果不取出爬片，二甲苯则会溶解孔板。项晓人等4研究的大批量培养细胞爬片的染色方法的简易装置仍是针对传统的细胞爬片，使用橡胶管固定爬片，会出现在二甲苯中胶管容易老化的现象。李宏等高密度阵列式细胞爬片培养装置、贮存装置及实验装置，也都是针对细胞爬片中的繁琐过程设计的，但存在现尚未市场化和比该方法造价高的问题。如果购买专门的Lab-Tek腔室玻片则造价太高。4）改良的爬片方法与传统爬片方法一样，可以进行连续培养，并可进行诱导或加药。因为筒管与载玻片之间用中性树胶粘贴，比较容易出现粘贴不牢的情况，连续培养应在5天之内，这是不如传统爬片的地方。载波片与筒管之间的粘贴剂要符合以下条件：（1）粘贴紧密，不渗夜，可以通过物理或化学方法方便分离；（2）可经受高压灭菌；（3）对细胞没有毒性作用。尽管使用中性树胶作为粘贴剂，对细胞可能存在潜在毒性，如果短期培养（5天之内）则不受影响。试验过程中，使用ECa-109食管癌细胞株、HK-2肾小管上皮细胞株、脐带血间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、鼠胚肺成纤维细胞用改良方法进行细胞爬片，均未发现有细胞污染和增殖受限情况发生。也可以考虑使用甲基纤维素等无毒粘贴剂。为了解决粘贴剂可能对细