药学专业大学生创新训练计划申请书.doc

。2013年度国家大学生创新创业训练计划申报书 基于菜豆假单胞菌毒素的生物源除草剂开发及抗性基因资源挖掘指导教师：团队成员：2013年 3月武汉大学2013年度大学生创新创业训练计划申报书填表时间：2013 年 03 月 10日项目名称基于菜豆假单胞菌毒素的生物源除草剂开发及抗性基因资源挖掘 项目创新特色概述 开发环境友好型的生物除草剂Phaseolotoxin，打破跨国公司草甘膦和草铵膦的垄断地位 改造Phaseolotoxin产生菌株的抗性基因，开发具有自主知识产权的除草剂抗性基因，为开发转基因抗除草剂作物储备基因资源 综合利用基因工程、细胞工程等分子生物学技术进行开发研究项目所属一级学科理学、农学（跨学科）申请经费10000元起止时间2013年3月至2015年5月申请人或申请团队信息姓 名学 号院（系）、专业联系电话E-mail() 导师信息姓名院（系）职称联系电话E-mail1、 申请理由1. 知识条件 经过一年多的专业知识学习，我们已经初步掌握了有机化学、微生物学、微生物药物学、生物化学等专业基础知识并在实验课中加以运用，加深了理解，同时具备了一定的实验仪器操作能力和实验设计能力。近期，小组成员查阅了大量有关菜豆丁香假单胞菌毒素(Phaseolotoxin)的文献，并多次与指导老师分析讨论现有的问题，已经初步了解其生物合成机制和调节机制，并提出了自己的研究内容和技术路线。在这些基础知识的指导下，我们有信心完成预期实验目标，解决一些实际问题。2. 专业优势 生物制药是综合运用微生物学、生物学、医学、生物化学、等学科研究成果的一门新兴学科，意味着我们有更广泛的知识资源以供查阅学习，自身知识、实验技术更全面。本学期又开设了基因工程、细胞工程、酶工程、细胞生物学、分子生物学等课程，对我们从事生物制药方面的研究具有指导意义。3. 团队优势 姓名 特长 兴趣 生物化学、英语阅读、组织管理生物化学、基因工程 微生物药物学、英语阅读、波谱分析仪器分析、生物合成 微生物学、英语阅读、仪器分析基因工程、波谱分析 生物化学、英语阅读、微生物药物学细胞工程、生物合成 生物信息学、英语阅读、基因工程微生物学、波谱分析 .老师多年从事微生物来源的含磷天然产物的发掘与生物合成研究工作，积累了丰富的经验；小组成员各有所长，这些不尽相同的特长会使我们这个团队更具有凝聚力，扬长避短，共同进步。对有机合成浓厚的兴趣，吃苦耐劳的精神，严谨的科学态度，挑战新方法的勇气都将是我们进行研究坚实的基础。我们有决心投身科研，创造新的知识和价值。4. 外部条件 武汉大学药学院组合生物合成与新药发现教育部重点实验室汇集了微生物学、微生物药物学、分子生物学、细胞生物学、生物化学、化学、药理化学、生物信息学等跨学力量，有着强大的师资、科研团队，实验室设备齐全，完全有能力进行此项目的研究。二、立项背景 草害是导致作物减产的最主要因素之一，每年导致全球农业950亿美元损失。而一般被认为是农业生产大忌的植物病害和害虫，则分别排在第二、三位。中国农田草害面积约7880万公顷，在每年投入235亿元人民币杂草防除费用情况下，仍然造成粮、棉、油损失1460万吨，直接经济损失近千亿元人民币（2011年数据）。 1 1、打破草甘膦、草铵膦在除草剂市场和转抗除草剂基因种子市场的垄断势在必行 目前市场流行较广的化学除草剂主要有以下几类：生长调节剂类、光合作用抑制剂、氨基酸生物合成抑制剂、脂肪生物合成抑制剂、细胞分裂抑制剂等。 化学除草剂在防治杂草方面具有效果好、工效高、成本低及简便易行等特点，但是化学除草剂广泛的使用带来的负面影响也日益明显。大量施用化学除草剂带来了环境污染危机，长残效除草剂的应用引起了残毒药害，一方面增大了农副产品的使用威胁，另一方面也导致下茬作物减产甚至土地退化。目前全世界已有约100余种化学除草剂在30余个国家被禁用或取消登记。抗药性杂草种群已然形成，全球已发现188种杂草的324个生物型对19类化学除草剂产生了抗药性，使得药效降低、用药量增加、成本提高，也更加重了污染。正是由于化学除草剂导致的这种威胁，也就增强了市场对研制广谱、高效、低毒生物除草的技术需求。发展绿色除草剂特别是生物除草剂替代化学除草剂，是解决这一矛盾的重要途径。2 开发新型的转抗除草剂基因的作物并推行其广泛的种植在国内具有广泛的应用价值。美国孟山都公司开发研制的与农药草甘膦配套使用的转基因种子畅销全球。因为如果用上孟山都的种子，以后每年都要向它购买。如果你自己留存种子，三代之后，产量就会下降，一代不如一代，甚至不如原来的普通种子，孟山都称之为“技术保护系统”。中国每年有80%的大豆种子依赖进口，在所有进口的大豆种子中，90%以上都是采用孟山都的技术种植出的转基因大豆。如果你要买孟山都的种子，就必须同时买它的草甘膦除草剂“农达”Roundup。 我国种子企业前20强的销售总额加起来还不如一个美国孟山都，多数科研院所实力不强，成果转化不畅 。据公开的资料显示，目前世界前10强的种业企业在世界种子贸易额中所占份额达35%，而我国前10强种业企业同期只占全球种子市场销售额的0.8% 。种业的“入侵”是外资向我国农业各领域渗透的重要标志。随着经济全球化进程加速，一些跨国公司凭借其多年形成的科研和经营优势，正在快速占领我国农业市场、谋取垄断地位。开发我国具有自主知识产权的转抗除草剂基因作物有许多优点，如：新型的除草机制在自然界不具有天然抗性的后顾之忧，因此可以减少农药的使用量，降低成本问题；开发的广谱除草剂可杀死所有的杂草，避免了农民二次田间施工除草的工作，根本上节约了劳动力；自主的知识产权防止了国外公司的垄断，防止了巨大的经济资金外流。国际上商品化最成功的转基因作物和农药配套使用以达到杀草不杀作物的农药有两种：一是化学除草剂草甘膦，二是生物除草剂草铵膦。 草甘膦（Glyphosate）是70年代开发最为成功的一个除草剂。由于它杀草谱广、具有良好的内吸传导性能,在防除多年生深根性恶性杂草上显示非常突出的优点,加上对人畜安全,不污染环境, 从而在农、林、牧业上得到广泛的应用,已成为世界上少有的大吨位除草剂品种。3-5 美国孟山都公司利用生物技术从1988年进行抗草甘膦的大豆新品种培育,到1995年已获得抗草甘膦大豆新品种。目前，国内也有大量科研人员在进行转草甘膦抗性基因作物的开发，已取得较大进展。如中国农业科学院生物技术研究所林敏等人。 关于草甘膦的除草机理，目前研究公认的是：草甘膦抑制芳香氨基酸的生物合成6 抗草甘膦转基因植物是由于转入了用含草甘膦培养基筛选培养的抗草甘膦的EPSP合成酶（5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶）的大肠杆菌基因，该酶是一种重要的氨基酸代谢酶，而且，转基因植物也具有更高浓度的酶，能耐受更高浓度的草甘膦。7 草铵膦(Glufosinate ammonium)由赫斯特公司80年代开发成功（后归属于拜耳公司），属广谱触杀型除草剂，内吸作用不强。许多杂草对草铵膦敏感，在草甘膦产生抗性的地区可以作为草甘膦的替代品使用，不过价格较高（目前原药价格大约为草甘膦的10倍左右）。其作用机理大致为：草铵膦的靶标酶是谷氨酰胺合成酶(GS),草铵膦抑制植物GS的活性8。抗草铵膦（Phosphinothricin，PPT）转基因植物是由于转入了从链霉菌中分离的PPT乙酰转移酶，该酶通过乙酰化PPT，酰化产物无抑制谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，故不会积累有毒氨水（NH3是GS酶底物）杀死植物。9目前，市场上已经进入商品化的具有配套抗性转基因作物的除草剂主要有以上两种，中国至今为止还没有一项拥有自主知识产权的生物类除草剂，抗性基因资源也严重贫乏。随着时间的推移化学农药终将被生物源农药取代，本课题研究的菜豆丁香假单胞菌毒素将具有重要意义。 2.菜豆丁香假单胞菌毒素(Phaseolotoxin)是一个潜在的生物源除草剂，其抗性基因具有开发转基因作物的价值 菜豆丁香假单胞菌毒素(Phaseolotoxin)是一种由菜豆丁香假单胞菌(P.syringae pv.phaseolotoxin)产生的三肽类毒素(homoArg-Ala-PSOrn)，分子内含有特殊的标志性的三个N-P结构，其药效基团为PSOrn。10Phaseolotoxin药效基团PSOrnAlahomoArg Phaseolotoxin的毒性机理：当Phaseolotoxin被植物细胞摄取后，会在植物细胞内发生水解，释放其活性部分PSOrn。PSOrn可以抑制植物体内鸟氨酸氨甲酰基转移酶(ornithine carbamoyltransferase,OCTase）的活性。11 而OCTase在植物体内精氨酸(Arg)的合成过程中发挥着重要作用，能将氨甲酰磷酸(carbamoyl phosphate)的氨甲酰基转移到鸟氨酸的N的氨基上，生成瓜氨酸，进而生成精氨酸。12 PSOrn就是通过抑制OCTase的活性，导致植物不能合成精氨酸而死亡。13 植物体内精氨酸的合成途径是统一的，因此Phaseolotoxin几乎对所有植物都具有毒性；与草甘膦、草铵膦相比较而言，Phaseolotoxin对植物的毒性更大，而对人类及其他动物的毒性更小，且Phaseolotoxin在土壤中更易降解，对环境的污染较小，因此Phaseolotoxin具有开发成除草剂的巨大潜力。 菜豆丁香假单胞菌的抗性机理：菜豆丁香假单胞菌之所以能够产生Phaseolotoxin而生命活动不受影响，是因为其体内含有两套精氨酸合成机制，正常情况下即由OCTase催化合成，一旦产生Phaseolotoxin，编码OCTase的基因活性即丧失，但在Phaseolotoxin合成基因簇中存在另一个基因argK，它编码的OCTase类似物具有双重功能，既可催化合成精氨酸又可避免Pheseolotoxin识别，从而保证正常的生命活动。argK即为Phaseolotoxin抗性基因。 由于Phaseolotoxin植物的毒性不具有选择性，因此若只单纯地开发Phaseolotoxin除草剂，那么除草的同时，农作物也会被杀死，因此将argK抗性基因转入农作物，获得Phaseolotoxin抗性农作物，与Phaseolotoxin配套使用显得尤为重要。 Phaseolotoxin的生物合成途径：Phaseolotoxin的基因簇已被测定，包括23个基因，14 预测有10个基因参与其合成。15 基因 编码的蛋白质 蛋白质功能预测 phtA PhtA Sulfotransrerase(磺基转移酶） phtE PhtE PEP Synthase(磷酸烯醇式丙酮酸合酶） phtJ PhtJ Deoxycytidine Deaminase(脱氧胞啶脱氨基酶） phtK PhtK Deoxycytidine Deaminase(脱氧胞啶脱氨基酶） phtL PhtL Pyruvate Phosphate Dikinase(丙酮酸磷酸双激酶） phtO PhtO Sulfate(硫酸酯酶） phtQ PhtQ ATP Grasp Domain(三肽连接酶） amtA AmtA Amidinotransferase(脒基转移酶） phtS PhtS Adenosine Phosphousulfate Kinase(APS激酶） phtU PhtU ATP Grasp Domain(二肽连接酶） 第一步：三肽链的合成 AmtA催化下，蛋白氨基酸Arg和Lys转化成非蛋白氨基酸Orn和hArg；PhtU是二肽连接酶，可以将Ala和hArg连接生成二肽Ala-hArg；PhtQ是三肽连接酶，催化Orn连接到二肽上，生成三肽Orn-Ala-hArg，15 至此Phaseolotoxin的基本骨架已经合成。第二步：三个N-P键的合成 Phaseolotoxin分子中，最能代表其结构特殊性的即为三个N-P键，但目前对其合成机制还不了解。又由于该结构位于Phaseolotoxin药效基团内，很有可能与其药效有关，因此明确其合成机制非常具有价值。哈佛医学院Rebecca F.Roush等人预测基因phtE 、phtL、phtJ、phtK参与此过程。第三步：磺化 磺化是Phaseolotoxin合成的最后一步，由PhtS、PhtA或PhtO共同催化完成。PhtS负责提供活化的磺酸基团，PhtA或PhtO负责将磺酸基团转移至Phaseolotoxin前体上，合成Phaseolotoxin。 3.自然状态下的Phaseolotoxin生产工序及argK基因的抗性还不足以进行除草剂的开发和转基因作物的研究很多因素限制Phaseolotoxin的合成：Phaseolotoxin的合成受很多因素的影响，如温度，研究表明，只有在18-20情况下，Phaseolotoxin才能正常合成，28时，很少合成；高于30，基本不合成。16 这些因素导致Phaseolotoxin自然状态下的产量很低，远远达不到工业生产和农业使用的要求。自然状态下的argK基因抗性很低：由于菜豆丁香假单胞菌体内的抗性基因argK只用来保护自身不受Phaseolotoxin的影响，对argK的抗性要求不高，因此自然状态下的argK还不足以进行转基因抗性作物的开发。墨西哥科学家曾将自然状态下的argK基因转入烟草中，结果获得的转基因烟草对Phaseolotoxin的抗性只有60%，17 还不足以与Phaseolotoxin除草剂配套使用。因此必须通过基因工程等科学技术人工地提高Phaseolotoxin的产量、增强argK基因的抗性。参考文献1 强胜.生物除草剂的研究概况.杂草科学,1996,(2):1114.2 李水清,赵春.我国生物除草剂的研究进展.湖北农学院学报,2003,(2):135139.3 丛志.广谱内吸传导性除草剂草甘膦.热作科技通讯,1977,(2):21-24.4 丛志.广谱的传导性除草剂草甘膦.农药工业,1997,(6):51-54.5 陈虎保,朱惠香.广谱高效低毒除草剂与抗除草剂作新品种.植物细胞工程与育种,1990,403-406.6 陈虎保,朱惠香.草甘膦的作用机理及部位.林业科技通讯 FOREST SCIENCE AND TECHNOLOGY, 1997,(1):2325.7 韩思宁,金龙国,蒋凌雪,陶波,邱丽娟.抗草甘膦真菌的分离鉴定及其功能基因表达.作物杂志 Crops,2012,(6):8288.8 贾士荣.转基因植物食品中标记基因的安全性评价.中国农业科学,1997, 30,(2): 1-15.9 张宏军,倪汉文,周志强,江树人.中国农业大学学报 Journal of China Agricultural University,2002,(5):5460.10 Mitchell,R.E；Bieleski,R.L.Involvement of Phaseolotoxin in Halo Blight of Beans:Trans- port and Conversion to Functional Toxin.Plant.Physiol. 1997,60(5),723-729. Moore,R.E；Niemczura,W.P.；Kwok,O.C.H.；Patil,S.S.Inibitors of Ornithine Carbamoyltran- sferase from Pseudomonas syringae pv.phaseolicola.Revised Structure of Phaseolotoxin. Tetrhe-Dron Lett.1997,25(36):3931-3934.11 Staskawicz,B.J.；Panopoulos,N.J.,A Rapid and Sensitive Microbiological Assy for Phaseolotoxin.Phytopathology .1979,69(6):663-666. Templeton,M.D.；Sullivan,P.A.；Shepherd,M.G.The inhibition of ornithine transcarbamoy- lase from Escherichia coli W by phaseolotoxin.Biochem.J.1984,224(2):379-88.12 Bachmann,A.S.；Matile,P.；Slusarrenko,A.J.Inhibition of ornithine decarboxylase Activity by phaseolotoxin:Implications for symptom production in halo of French bean. Physiological and Molecular Plant Pathology.1998,53(5-6):287-299. Turner,J.G.,Effect of Phaseolotoxin on the Synthesis of Arginine and Protein.Plant Physiol.1986,80(3):760-765.13 Turner,J.G.,Effect of Phaseolotoxin on the Synthesis of Arginine and Protein.Plant Physiol.1986,80(3):760-765.14 Aguilera,S.；Lopez-Lopez,K.；Nieto,Y.；Garciduenas-Pina,R.；Hernandez-Guzman,G.； Hermandez-Flores,J.L.；Murillo,J.；Alvarez-Morales,A. Functional characterization of The gene cluster from Pseudomonas syringae pv.phaseolicola NPS3121 involved in Synthesis of phaseolotoxin.J.Bacteriol.2007,189(7):2834-43.15 Rebecca F.Roush；Christopher T.Wslsh.Biosynthesis of N-P Bond Containing Peptide Natural Products.ProQuest Dissertations and Theses.2011.16 Aguilera,S.；Lopez-Lopez,K.；Nieto,Y.；Garciduenas-Pina,R.；Hernandez-Guzman,G.； Hermandez-Flores,J.L.；Murillo,J.；Alvarez-Morales,A. Functional characterization of The gene cluster from Pseudomonas syringae pv.phaseolicola NPS3121 involved in Synthesis of phaseolotoxin.J.Bacteriol.2007,189(7):2834-43.17 Juan Manuel de la Fuente-Martinez,Giberto Mosqueda-Cano,Ariel Alvarez-Morales,Luis Her- ra-Estrella.Expression of a bacterial Phaseolotoxin- resistant Ornithyl transcarbamyl- ase in transgenic tobacco confers resistance to Pseudomonas syringae pv.phaseolicola Natura.1992. 三项目方案项目I. 提高菜豆丁香假单胞菌毒素(Phaseolotoxin)的产量 自然状态下的Phaseolotoxin产量一般很低，且容易受自然环境等各种因素的影响，若要实现Phaseolotoxin的可商业化生产，就要针对影响其合成的各种内在和外在因素，合理地对参与其合成的基因进行改良，使其在复杂的环境中，始终保持Phaseolotoxin的高产性。 方案1. 增强Phaseolotoxin基因簇的温度适宜性 研究表明，只有当环境温度在18-20范围内，假单胞菌才能合成Phaseolotoxin，高于30时基本不合成。但在工业生产上，为了使宿主细菌繁殖速度和发酵速度最大化，通常需要在30下培养发酵。因此可以对参与Phaseolotoxin合成的基因进行改造，使其对温度的敏感性降低，在更广泛的温度范围内都保持Phaseolotoxin的高产性。 1.1实验材料： 菜豆丁香假单胞菌（即原始菌株） 1.2实验过程： 1.2.1将抗性基因argK及各个与合成相关的基因的启动子替换成铜绿假单胞菌中的强启动子P1（该启动子可在30下表达）； 1.2.2改造菌株发酵培养，检测Phaseolotoxin产生量并与正常菌株比较。 方案2. 基因表达能力的提高 目标产物由多个基因控制合成，根据木桶原理，转录翻译能力最弱的基因决定合成效率。因此可以通过增强最弱基因的转录翻译能力，从根本上提高Phaseolotoxin的产量。基因表达可以在多方面进行调控，本方案采用转录水平调控，用强启动子代替基因原来的启动子，从而提高基因的转录翻译能力。2.1实验材料：菜豆丁香假单胞菌（即原始菌株），假单胞菌中的强启动子P12.2实验过程： 2.2.1采用Northern印迹法，通过测量转录出的mRNA的量来确定转录能力最弱的基因； 2.2.2通过基因操作，用铜绿假单胞菌中的强启动子P1代替该基因的启动子； 2.2.3检测Phaseolotoxin产量单位数，与未改良的宿主菌进行活性、产量对比。方案3. Phaseolotoxin药效基团的异源表达合成Phaseolotoxin是三肽类毒素（homoArgAlaPSOrn），其药效基团为PSOrn。如果只合成的它的药效基团，而不合成“二肽尾巴”（homoArgAla)，就可以降低物质和能量的消耗，提高Phaseolotoxin的合成速率。 由合成路线可知，参与药效基团合成的基因有phtA、phtE、phtL、phtJ、phtK、phtO、phtS,因此可将与药效基团合成无关的基因敲除或将合成药效基团的基因组装起来，构建一个只合成药效基团的合成途径，这样就可以减少合成步骤，降低物质和能量消耗，以期提高毒素的产量。3.1实验材料： 宿主菌铜绿假单胞菌3.2实验过程： 3.2.1限制性内切酶技术与PCR扩增技术结合克隆与药效基团合成相关的基因，按照Phaseolotoxin基因簇中基因排列顺序，用DNA连接酶组装成药效基团基因簇； 3.2.2选择合适的载体和药效基团基因簇，进行启动子改造和密码子优化，将重构基因簇导入异源宿主菌（铜绿假单胞菌)； 3.2.3发酵培养，检测药效基团的活性和合成单位，并与原始菌株相同环境下相同时间内的相关数据比较，优化异源表达系统。项目II. 改良抗性基因argK，开发转基因植物本方案拟采用基因工程和蛋白质工程的方法，对Phaseolotoxin抗性基因进行优化改良，以提高其抗性。然后筛选合适的位点拆分argK，建立argK-C和argK-N转化模式植物的方法，为开发转基因作物打下基础。 1.实验材料： 野生型烟草（Nicotiana tabacum L.），菜豆丁香假单胞菌NPS3121（Pesudomonas syringae pv. Phaseolicola strain NPS3121），大肠杆菌BL21（Escherichia.coli BL21），pET28a质粒等。 2.实验步骤: 2.1 抗性基因argK的优化改良 2.1.1 易错PCR扩增 设计引物，采用易错PCR扩增并诱导目的基因argK发生随机性突变，得到具有不同位点的突变基因argK。 2.1.2 构建质粒重组 将突变基因装载到大肠杆菌超量表达载体pET28a，得到重组质粒。 2.1.3 原核表达，筛选优良突变基因argK 将重组质粒转到大肠杆菌BL21中，挑取单菌落接种于含有高浓度Phaseolotoxin的培养基中，经抗性梯度培养后寻找存活下来的大肠杆菌，筛选抗性增强的Phaseolotoxin抗性基因argK。 2.1.4 真核表达，检验活性 对优良抗性基因进行修饰及加工，使其能在真核细胞中表达。将加工后的抗性基因导入目标植株野生型烟草中，检验其活性。 2.2 拆分改良型基因argK并导入目标植株野生型烟草（Nicotiana tabacum L.） 花粉易携带抗性基因漂移产生超级杂草。目前解决思路是：由于花粉中只含有染色体DNA,而叶绿体DNA不能随植物花粉转移,因此可将改良型argK基因拆分成两个没有活性的基因片断,一断整合在染色体DNA 上,另一断插入叶绿体DNA 中。这样花粉中只携带没有活性的部分基因片断,而避免了抗性基因的漂移产生超级杂草的安全性问题。 2.2.1 抗性基因argK拆分位点的确定1 根据argK的碱基序列，利用蛋白质三维结构预测分析网站/对其抗性蛋白进行结构预测，找到结构域的交接位点。 继续利用GPS-LS 接点扫描系统(Tn7 Linker Scanning System)精确寻找改良型argK基因能够进行拆分的位点。利用Tn7转座在靶DNA的随机位点上插入15bp(即编码5个氨基酸短肽)的外源片段，通过鉴定目的蛋白能否忍受少量外源氨基酸多肽的插入来寻找可能的拆分位点。 2.2.2 抗性基因的拆分与intein介导载体的构建 采用PCR方法，从上述的可拆分位点处将改良型argK基因拆分成N端与C端两个片段，称为argK-N和argK-C 然后分别与Ssp DnaE内含肽片段对应基因intein的N端和C端融合。见下图详解： 2.2.3 农杆菌介导融合基因转入烟草愈伤组织2 在野生型烟草（Nicotiana tabacum L.）中，利用农杆菌介导将融合基因N端插入核基因组，融合基因C端插入叶绿体基因组。在细胞核内和叶绿体内表达的前体蛋白中的内含肽可以互相识别进行蛋白剪接,形成了一个完整的有功能的目的蛋白产物,即抗除草剂蛋白,转基因植株对除草剂表现出抗性。通过用含有Phaseolotoxin的培养液培养烟草愈伤组织，筛选产有抗性蛋白而存