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时间分辨技术培训资料1 现有的免疫学方法有几种。有五种，分别为放射免疫、酶标免疫、荧光免疫、化学发光、时间分辨荧光免疫（TRF）。2 现有的免疫学方法灵敏度最高的是那种。灵敏度最高的为时间分辨荧光免疫（TRF）10-18mol/L，而酶标免疫为10-9mol/L，放射免疫和荧光免疫为10-12mol/L，化学发光为10-15mol/L其中的电化学发光为10-17mol/L。3 什么是时间分辨荧光免疫（TRF）。TRF分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，当反应体系发生后，用TRF仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓度，达到定量分析之目的。4 TRF技术是谁提出的。1979年，芬兰SOINI和HEMMIA提出了“时间分辨荧光免疫分析”理论，1983年SOINI和KOJOLA提出以镧系元素标记为示踪螯合物和时间分辨荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量分析技术，现已经成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段。5 现有的免疫学方法有几种标记物。现有的标记物有五种，分别为酶、同位素、荧光素、发光大分子物质、原子。6 TRF的标记物是什么。TRF的标记物是原子，采用的是镧系元素中的Eu铕、Sm钐、Te铽、dy镝及其螯合剂。7 TRF原子标记物的特点。l 发射光和激发光有较大的STOKES位移-高特异性l 长寿命荧光，降低其他干扰-高灵敏度l 半衰期长达几十万年，受干扰小-高稳定性8 原子标记与大分子标记物的对比。 原子标记物大分子标记物标记位点多个，可达20个只有1个对被标记物蛋白活性影响影响小，基本无影响影响大，经常影响蛋白活性对被标记物空间结构影响无影响，保证稳定性影响大，造成试剂的不稳定受环境因素的影响影响小影响大，受温度，9 TRF技术中有几种分辨。TRF技术中的分辨有两种分辨组成：时间分辨和波长分辨。10 为什么叫时间分辨。（图1） 生物制品（如蛋白质）本身产生的荧光波长位于400-600nm，几乎覆盖整个可见光的波长范围，所以用普通荧光素来检测生物样品时，自然本底的荧光干扰太大。而在TRF技术中，由于镧系稀土离子螯合物所产生的荧光不仅强度高，而且半寿期也长，介于10-1000us之间，比普通荧光标记物高5-6个数量级。样品中蛋白质类的本底荧光衰变时间约为1-10ns（1000ns=1us）而我们使用的标记物铕和钐的荧光衰变时间分别为730000ns和50000 ns。因此利用延缓测量时间，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（详见图1）。消除了来自样品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏度。这既是我们常提到的时间分辨。11 为什么叫波长分辨。 在TRF技术中检测的荧光信号是被动产生的荧光，所以就存在激发光和发射光。稀土离子的荧光激发光波长范围较宽，有利于增加激发能，提高稀土离子标记物的荧光信号。而发射光波长范围很窄，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。同时激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移（铕约为290nm），这十分有利于排除非特异荧光的干扰（既激发光对要检测的发射光的干扰），极大地增强了荧光信号测量的特异性，这就是TRF中波长分辨。（见图2）12 什么叫Stokes位移。 Stokes位移是光学中的的概念，是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。例如TRF中铕的激发光波长340nm,发射光波长613nm，两者之间的波长差即Stokes位移约为290nm，所以激发光和发射光很容易用干涉滤光片分开（如图2）。而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差即Stokes位移为28nm，那就很难排除激发光对发射光的干扰，影响检测结果。稀土离子激发光、发射光和Stokes位移稀土离子螯合物激发光波长（nm）发射光波长（nm）Stokes位移（nm）Eu-螯合物340613273Sm-螯合物340600260Tb-螯合物295490/543195/248Dy-螯合物29557327813 TRF的反应原理是什么。（图3）三价稀土离子螯合剂在水溶液中很容易与抗原分子以共轭双键结合，形成螯合物，当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，反应后，免疫复合物中抗原抗体结合部分，就含有稀土离子，将结合和游离部分分开，利用分析仪器测定复合物中稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。14 放射免疫的优缺点。 应用：1放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。2夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。缺点：1. 放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）2. 125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。3. 标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。4. 操作繁琐，出报告时间长。5. 无法保存备用。15 酶标免疫的优缺点。应用：1酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。2. 试剂有效期较长。3.衍生技术：1) 荧光酶免疫分析2) 增强化学发光酶免疫技术3) 磁酶免技术4. 曾经一度被认为是取代放免的检测手段。缺点：1. 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。2. 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。16 磁酶免的优缺点。 优点：仪器较便宜，激素种类较全，仪器体积较小缺点：操作很繁琐，对环境要求高，1/3量测试对操作员的操作水平要求高，误差很大17 化学发光目前有几家。 有5家，为贝克曼、雅培、拜耳、德普、罗氏。18 化学发光的优缺点。优点：快速检测，急诊很好，自动化程度高缺点：试剂消耗很贵，对环境要求高，自动化程度高带来的一次性特点，不能重复检测，断电或者故障将造成巨大浪费19 TRF的那些优点。简单总结为：零本底、高特异性、灵敏度更高、重复性更好、示踪物稳定、标准曲线线性范围宽、试剂保质期长至少一年、多标记、不受样品自然荧光干扰、操作简便、无放射性污染、等优点20 为什么TRF会成为取代酶免，放免最具竞争力的方法？1） 中国国内关于TRF技术长时间的基础研究2） 化学发光从其成本来看，是很难象酶免和放免那样普及3） 化学发光的本身对自动化程度的和环境的高度要求是其普及的障碍4） 生物芯片技术还象雾里看花，距离成熟和应用还有很长时间的路5） 时间分辨技术的稳定和高特异性对中国这个地广不同环境气候的国家是很适用的6） 大规模国产试剂的推出将会使该技术在中国的应用达到最为广泛的程度7） 进口全自动和国产半自动仪器的推出使得中国绝大部分医院有能力使用这个平台21 TRF技术与化学发光的比较。时间分辨荧光化学发光发光效率95%1%重复检测可无数次不可重复本底噪声零本底干扰大灵敏级数10-1810-15标记物原子大分子化合物标记位点可达20个/抗体1个/抗体标准曲线稳定达一年以上稳定 2 到 4周多标记有，最多可达四标记无科研开发有无22 TRF技术与电化学发光的比较。时间分辨荧光电化学发光标记物四种原子: Eu, Sm, Te, Dy一种原子: 钌多标记技术有无做科研能(1000多种科研项目无 试剂种类58种临床,24种科研,共82种40种临床, 无科研试剂价格低高23 为什么说只有TRF技术可以无数次重复检测，其它方法不能。 因为TRF技术是采用在外部激发能的激发下被动产生发射信号的一种检测原理，什么时候外部给激发能什么时候就会产生检测的发射信号；而其它方法采用的都是检测标记物自身的OD值、荧光、化学发光等信号，这种检测都是一次性的而且必须在一定的时间内完成时间长了将检测不到信号，如想再检测一遍则必须重新实验。用一个形象的比喻：TRF技术就如高速公路上的路牌，汽车灯照一下路牌就会亮一下；其它方法就想一根火柴点着后亮一会就烧完了，想再亮就必须再拿出一根火柴。24 为什么化学发光会因仪器故障浪费大量的试剂，而TRF不会。正如前面所说的化学发光的反应过程就如一根火柴的燃烧的过程，试想一根已经烧了的火柴突然灭了，想再重新自己点燃可能吗？同理，加了一半的试剂的反应，突然停止的话，想在开始的话，就只能重新用新的试剂从头开始做，前面反应一半的试剂就只能浪费了。而TRF技术中各步骤的操作是相对独立的，同时原子的标记物十分的稳定如高速公路的路牌经受起风吹雨打，使TRF检测出现仪器的故障时可将反应中的样本保存在冰箱中，等仪器修好后再接着停下时的步骤继续实验，去接受汽车的照射。25 为什么TRF技术的发光效率可达95%，而化学发光只有1%。 因为TRF技术中标记物的物理特性使检测荧光的本底干扰为零，故检测时检测到的全为特异性荧光，同时所检测的发射光波形特别窄（6135nm）（见11问图）这样的话保证我们在613nm检测发射光时能将大部分特异性荧光检测到，故TRF技术的发光效率可达到95%。化学发光的标记物是大分子的发光物质，其所发的光为可见光波谱含概了所有的光的波长，而其检测仅为540nm一点，那么就有大部分光没有被检测，故化学发光的发光效率只有1%。26 TRF技术具有独一无二的多标记技术，什么叫多标记。 因TRF技术中标记物采用的是镧系元素中的Eu（铕）、Sm（钐）、Te（铽）、dy（镝）及其螯合剂。不同的三价稀土离子具有不同发射光谱和各自不同的荧光寿命等特点，这样就适合进行双标记和多标记，从而实现可同时检测一个样品中，两种或两种以上的抗原或抗体，即一个试剂盒相当与两个试剂盒或多个试剂盒，这就是我们所说的多标记技术。27 目前有的多标记试剂盒几种，未来会有那些。 目前有PSA F/T和AFP/HCG两种多标记药盒，未来我们将开发更多的多标记药盒例如将T3、T4或FT3、FT4做到一个试剂盒里，将多个肿瘤标志物做到一个药盒里，我们想这些试剂盒推出以后将会极大的降低用户的成本。28 TRF技术中增强液的作用。 将标记物从免疫复合物上解离，形成新的螯合物，增强免疫反应复合物的荧光强度29 什么叫解离增强技术。 解离增强技术是TRF技术中所特有的，它是指当免疫反应完成后部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。这时加入低PH值的增强液，把Eu或Sm从免疫复合物中解离下来，与增强液中的螯合物质结合形成新的螯合物，使标记物产生的荧光强度增强近百万倍。 30 解离增强技术带来了那些优点。 带来了高的灵敏度，线性范围更宽，重复性更好。31 TRF试剂的有效期是多长。 试剂的有效期长达1年，有些可有2年有效期，我公司保证半年以上的有效期。32 TRF试剂标准曲线的稳定性是多长。 对与同一批号的试剂标准曲线稳定性长达一年。33 为什么TRF试剂有这么长的稳定性。 与时间分辨的镧系元素标记物的稳定特性相关，标记元素有很好的稳定性，不会衰变也不易解离或变性。34 TRF在国外的研究情况现状。 国外已经在PCR定量检测、核酸探针分析广泛应用，多标记技术等方面也进展很大。35 国内开展TRF的研究从什么时候开始的。 80年代中期开始，在理论上已经拥有雄厚基础36 国内外对TRF方法的评价是什么。 TRF是近十年发展起来的一种超微量分析方法，是目前最灵敏的微量分析技术，随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，TRF具有越来越大的应用空间。37 目前的TRF试剂种类。 分为传染病检查，内分泌科检查，肿瘤科检查，妇产科检查，血液科检查，遗传科检查和科研类试剂。38 总共有多少种试剂。种类多达82种，其中临床52种、科研24种。39 将要问世那些试剂。 传染病系列的乙肝两对半定量试剂、丙肝试剂盒、HIV试剂盒、梅毒抗体试剂盒。40 有那些试剂将在国内生产。 传染病系列试剂盒，以及将来甲状腺系列、性激素系列、肿瘤系列等试剂将采用进口分装生产。41 丰化公司将继续开发那些试剂。 现已经有进口配套试剂近60种 已经推出乙肝定量两对半即将推出丙肝、梅毒、爱滋进一步推出国产激素试剂，如甲状腺、肿瘤等42 TRF试剂有几种包装。 目前只有一种包装即96孔/盒。43 TRF试剂盒的组成。 试剂盒主要由96孔微孔测试板、标记液、缓冲液、参考标准品、增强液、浓缩洗液组成。44 各试剂盒中的增强液和洗涤液可通用吗。是通用的。45 TRF技术中一般的检测标本量。 各个实验是不同的都在40-200ul之间。46 同批不同盒的试剂是否通用。 可以合用。47 不同批号的试剂可以合用吗。原则上不可合用，但因试剂由不同的成分组成同批号的成分可合用。48 TRF试剂有无其它消耗品。 无其它消耗品。49 什么叫新生儿筛查。 控制人口数量，提高人口质量是我国的一项基本人口政策。新生儿筛查是提高人口素质的重要措施之一。新生儿筛查是指在非选择的新生儿中检查危害严重的先天性和遗传代谢疾病，以便能早期诊断、早期治疗，避免患者发生智能落后或其它严重影响身心健康的疾病。国际、国内资料均表明，开展和推广新生儿筛查具有重要的社会意义和经济效益。我国目前开展了先天性甲状腺机能减低症（CH）和苯丙酮尿症（PKU）两项针对引起儿童智能发育落后的疾病的筛查。50 什么叫产前筛查。 我国每年约新增二万六千六百例“先天愚型儿”（又称“唐氏儿” ），平均每20分钟出生有一个，发病率约占新生儿总数的1/750。每一例“先天愚型儿”将造成25万元人民币的社会经济负担，给家庭成带来的精神负担更是不可估量。十月怀胎，我们要的难道是这样的结果吗？ 母血产前筛查是通过定量测定母血中某些特异性生化指标，结合孕妇的晕周、年龄参数，并运用电脑统计分析软件计算出孕妇怀有“先天愚型儿”的风险。进而再对高风险的孕妇采取必要的临床诊断，以期达到最大限度避免和减少“先天愚型儿”出生目的。51 TRF在新生儿筛查和产前筛查的优势。 国际上70%的筛查采用TRF技术，该技术的先进和稳定获得保险公司的担保52 国家对新筛和产前筛查的政策。国家卫生部已经有文件要求各地普及新生儿的筛查和产前筛查，作为我国提高人口素质的重要课题。53 新筛和产前筛查的预期市场前景。 据测算全国每年有2000万新生儿出生，其中唐氏儿的出生率约3万名，他们的降生将对国家和家庭带来沉重的社会负担和经济负担，患有唐氏综合征的新生儿目前没有有效的治疗方法，病人生活无法自理需要家人全天照顾，并且寿命不长平均寿命约30岁左右，估计我国现有病人六十万以上，有关专家指出，我国每出生一例唐氏综合征患儿大约造成二十五万元人民币的社会经济负担。目前在美国，唐氏综合征产前筛查已成为一项普查的项目，每年约有240万孕妇做这项检查，在我国国家已认识到新生儿筛查和产前筛查的意义，国家计生委拟将新生儿的甲低和苯丙酮尿症筛查与唐氏综合征产前筛查做为一项普查在全国推广应用，到时每年销售试剂2000万份，其中新生儿的甲低和苯丙酮尿症筛查试剂销售价以20元人份，市场额为：4亿元人民币，唐氏综合征产前筛查试剂销售价以40元人份，市场额为：8亿元人民币，合计两项筛查共计有十几亿人民币的市场价值。54 国内目前采用TRF技术的新筛中心有多少，占总数的多少。 目前采用TRF技术的有50多家，占总数的60%以上。55 国内生产的TRF仪器有几种。 目前只有泰莱-I和AT2000两种。56 丰华公司的简介。57 泰莱-I的目标客户群。全国二甲和三乙医院 以及部分三甲医院、民营医院和一些研究机构58 整套泰莱-I的配置。主机、洗板机、振荡器、电脑、打印机、软件59 泰莱-I的检测速度。检测速度快（1样品/秒）60 泰莱-I的技术参数。灵敏度： 10-17 mol/well（Eu3+）线性度： 10-1710-12 mol/well (Eu3+)61 泰莱-I的操作软件系统。计算机控制、中文系统、人性化操作界面，简单、易学，中文报表软件62 泰莱-I能否打印综合报告单。 可以。63 手工操作加样就会比机器加样的结果误差大吗关键是操作人员尽量避免一些人为因素引起的误差，使用正确的加样方法。64 泰莱-I的安装要求。对操作的要求是略知道电脑知识，对环境没有特别要求，洁净即可。65 泰莱-I对实验室环境的要求。对湿度和温度没有特别要求，只是对实验室的结净度有一定要求。尘土不要太多。66 手工操作加样就会比机器加样的结果误差大吗。 手工加样的误差关键在于操作员的手法是否统一，统一的手法就只有统一的误差，这样在整个实验过程中的批内误差就非常小。而仪器加样本身也有同样的误差。故只要保证实验都是同一人操作批间误差也将会被控制在很小的范围内。67 国产化就代表品质差吗。通过中山大学附属第二医院和广东省妇保院68 客户对泰莱-I的评价。69 竞争对手分析（德普）。德普的化学放光IMMULITE是最早进入中国，最大优势是试剂品种较多，但由于其发光原理是酶放大化学发光，标记物是酶，受环境影响因素多，仪器对环境要求高，故障较多，目前在国内拥有近200台。70 竞争对手分析（拜耳）。拜耳的ACS180系统是真正的化学发光，其在中国的数量最多，约有230台，其最大的优势是急诊速度快，但其结果的灵敏度是较差的，而且试剂稳定性不好，经常做标准曲线的校正，浪费大量的试剂。71 竞争对手分析（亚培）。雅培的仪器有很多在检验科，其最大的优势是传染病系列的检测，其他激素项目不健全，发光原理负责，对实验室要求高，试剂附带消耗品多，且都需要花钱购买。72 竞争对手分析（贝克曼）。发光原理和德普类似，试剂由于采用微粒子技术，增加了反应灵敏度，但试剂成本高且很多附带消耗品的价格也高昂，另外肿瘤项目很少。73 竞争对手分析（罗氏）。方法学和时间分辨相比灵敏度相似，急诊速度快，但小时工作量是最少的，它的仪器和试剂购买和工作成本是最高昂的。74 竞争对手分析（磁酶免）。现市场保有量在1000台，由于仪器价格便宜，但试剂的操作很繁琐，环境要求高，且对操作员的技能要求也高。75 竞争对手分析（酶免）。目前使用最为广泛的技术，仪器和试剂的成本低，试剂开发最为健全，但受影响因素太多，所出结果是不太具有绝对价值的，灵敏度是最低，如在肝炎检测中的弱阳性是检测不到的。76 竞争对手分析（放免）。对环境和健康的重视是放免技术和市场越来越小77 丰华为什么要推出乙肝定量试剂盒。乙肝在中国有非常大的患者群体，而且是慢性病，目前检测乙肝均采用酶标方法，该方法只能定性，不能定量，并且检测灵敏度很低，对弱阳性一般检测不出。目前市场采用的定量是进口雅培试剂，成本昂贵，只有在先进发达的少数医院使用，所以，市场需求一种定量灵敏度高的但成本不高的检测试剂，丰华公司决定率先推出该项产品。78 TRF肝炎试剂的检测灵敏度。HBsAg 检测灵敏度为0.2ng。79 为什么还要推出其它传染病检测项目。国家对血液传染的重视越来越大，在一些级别医院已经开展了血液进出都要严格进行筛检，其中，乙肝、丙肝、梅毒、爱滋等都有做，这个市场非常大，而且越来越大，目前市场上缺少一种稳定性好，高灵敏度而且价格不高的试剂。80 TRF与国际厂家肝炎试剂比较。与他们有同样的临床价值和灵敏度，但价格是他们的1/2。81 TRF与酶标肝炎试剂的比较。价格比酶标试剂高，但不能一起比较，一是因为我们的试剂定量，他们定性；二是因为酶标试剂的灵敏度和稳定性不好，对临床的治疗跟踪没有意义。82 泰莱-I会给医院带来那些效益。1） 技术的领先性2） 临床的准确性3） 仪器和试剂成本低廉4） 很大的利润5） 良好的服务83 生产时间分辨的世界公司有哪几家？芬兰的WALLAC和加拿大一家公司，但加拿大使用激光，主要在科研，WALLAC和丰华公司使用shan灯，主要用于临床。84 在中国全自动时间分辨用户有多少家？有近50家，主要代表有上海华山、新华、中山、瑞金；北京北大一、二附院、北京妇产；华西医大；西安西京等85 在中国进口半自动时间分辨用户有多少家？有近50家，主要集中在各地妇产医院，因为半自动1420有两种方法检测功能：时间分辨和荧光，适用新生和产前筛查。86 为什么进口时间分辨仪器在中国发展不快？1） 宣传的不力，很多用户现在也不明白原理2） 仪器和试剂的成本与其他发光技术比较还是较高3） 对已有用户的服务不完备，影响进一步开拓