实验四 微生物的染色.ppt

第十章微生物的实验 实验一显微镜的使用及细菌 放线菌和蓝细菌个体形态的观察 一 目的 1 掌握显微镜的结构 原理 学习显微镜的操作方法和保养 2 观察细菌 放线菌和蓝细菌的个体形态 学会生物图的绘制 二 实验器材 1 显微镜 目测微计 物测微计 擦镜纸 香柏油 二甲苯 2 示范片大肠杆菌小球菌蓝藻等 二 实验内容1 显微镜的结构 1 机械部分 2 光学部分 2 光学部分a 目镜b 物镜 低倍物镜高倍物镜油镜物镜的性能由数值孔径决定数值孔径 n sina 2显微镜的性能还依赖于物镜的分辨力分辨力 能分辨两点之间的最小距离的能力增大数值孔径来提高分辨力 物镜N A 1 25 100 OI 160 0 17 16mm N A 1 25数值孔径100 放大倍数 OI 油镜160镜筒长0 17要求盖玻片的厚度16mm焦距C 聚光器d 反光镜f 滤光片 2 显微镜使用和保护 1 低倍镜的使用法 2 高倍镜的使用法 3 油镜的使用法3 目测微尺 物测微尺及其使用方法 1 目测微尺 2 物测微尺 3 目测微尺的标定 4 菌体大小的测量4 细菌 放线菌和蓝细菌个体形态的观察 四 实验报告 实验三微生物直接计数法 一 目的 1 明确显微镜计数的原理 2 学习使用血球计数板进行微生物计数的方法 二 仪器与材料显微镜血球计数板移液管酵母菌液 三 血球计数板的结构与计算方法 1 16 25的计数板计算公式细胞数 125小格内的细胞数 400 10 1000 稀释倍数 125 2 25 16的计数板计算公式细胞数 80小格内的细胞数 4 10 1000 稀释倍数 80 四 操作步骤 1 稀释样品使每格约5个细胞 2 取干净的血球计数板 用厚盖玻片盖住中央的计数室 用移液管吸取少许充分摇匀的待测菌液于盖片的边缘 菌液则自行渗入计数室 5 10min即可计数 3 将血球计数板置于载物台上 用低倍物镜找到小方格网后换用高倍镜观察计数每样品重复三次 取平均值 计算每1ml菌液中所含的酵母菌数 五 试验报告 实验四微生物的染色 目的学习微生物涂片染色的操作技术 掌握微生物的普通染色法 单染色法 和革兰氏染色法实验仪器和材料实验步骤单染色革兰氏染色 涂片干燥固定染色水洗吸干镜检 取大肠杆菌和枯草杆菌芽孢杆菌 均以无菌操作 分别做涂片 干燥 固定 方法同单染色法用草酸铵结晶紫染色1min 水洗 加革氏碘液媒染色1min 水洗斜置载玻片于一烧杯上 滴加95 酒精脱色 至流洗出的酒精不呈现紫色时 立即用水冲净酒精 脱色时间约20min 或视涂片厚薄而略有差异用番红 或称沙黄 染液染色1 2min 水洗吸干 置于显微镜下观察 阳性者为紫色 阴性者为红色革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度 如脱色过度 则阳性菌可被误染为阴性菌 而脱色不够时 阴性菌可被误染为阳性菌菌龄也影响染色结果 如阳性菌培养时间过长 或已死亡及部分菌自行溶解了 都常呈阴性反应 实验五培养基的制备及灭菌 一目的1玻璃仪器的洗涤和灭菌前的准备工作2掌握培养基的配制方法3会干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法二实验材料三实验内容1玻璃器皿的洗涤剂包装A洗涤培养皿 试管 锥形瓶等可用去污粉或肥皂 自来水冲净 移液管用洗液浸泡在水冲净 干燥 B包装1 培养皿牛皮纸包装2 吸管的吸端塞棉花约1 1 5cm 防细菌吸入口中 避免细管吹入 松紧适宜 用包装纸包移液管尖端 3 试管和锥形瓶等的管口均堵棉塞 并用牛皮纸包裹 2培养基的制备A步骤1 配制溶液取一定容量的烧杯盛入定量无菌盐水 按培养基配方逐一称取各成分 加水溶解 可加热促进 不断搅拌以防原料在杯底烧焦 2 调pH值测定培养液的pH 按要求以10 HClor10 NaOH调至所需pH 3 过滤用纱布 滤纸 棉花均可 若杂质少可省略 4 分装将培养基分装在试管或锥形瓶中 放置培养基玷污管口 避免浸湿棉塞引起杂菌污染 装入试管的量视1试管的大小定 一般斜面培养基时为其高度的1 4 1 35 斜面培养基的制作将装有琼脂培养基的已灭菌的试管趁热取出 斜置于木棒上 使其斜面长度为试管的1 3 1 2 代培养基凝固后即成斜面 B营养琼脂培养基的制备1 培养基配方 牛肉膏0 75g 蛋白胨1 5g 氯化钠0 75g 琼脂3g 蒸馏水150ml pH7 6 0 1Mpa下灭菌20min 2 操作 a取300ml烧杯一个 装150ml蒸馏水 b在药物天平上一次称取配方中各成分 水中溶解 带待琼脂完全溶解后停止加热 补充水分 用10 NaOH调pH 7 6 省略过滤 培养基分装五支试管中 余入250ml锥形瓶 塞上棉塞 包炸好待灭菌3无菌水制备1 取250ml锥形瓶装90ml蒸馏水 赛棉塞 包扎 待灭菌2 取5支18mm 18mm试管 分装9ml蒸馏水 4灭菌杀死全部微生物的营养细胞和它们的芽孢或孢子 灭菌方法过滤除菌 化学药品消毒 利用酚 甲醛等是细菌蛋白质变性灭菌 高温 紫外线等物理方法加热灭菌是主要的 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 湿热灭菌 后者在121oC灭菌15 30min 效果好 1 干热灭菌法 用于培养皿等玻璃仪器 包装好的上述物品放入恒温箱中 160oC维持2h 旋钮调至零 到50oC可取2 高压蒸汽灭菌 微生物试验所需仪器培养基 皆可用高压灭菌锅灭菌 2 灭菌操作过程A先加水 放物品 盖锅盖 对称的拧紧螺栓 防漏气 B加热 并开排气阀 冒热气3 5min后关 到所需压力计时 达灭菌时间后停止加热C压力为零开排气阀 取物D将灭菌后的培养基于37oC恒温箱24h 作无菌培养 若无菌生长 可保存备用 实验六微生物的纯种分离 培养和接种技术 一目的要求掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本要求二仪器材料三操作方法及步骤1微生物的纯种分离及培养 稀释平板法和平板划线法1 稀释平板法a取样用无菌锥形瓶取定量的会活性污泥b稀释水样将一瓶90毫升和5管9毫升的无菌水按10 1至10 6依次编号 无菌条件下用10ml移液管取10ml水样于第一瓶90ml无菌水中 摇匀即得10 1浓度的菌液 移液管吹洗3次 用1ml无菌移液管取1ml10 1浓度的菌液于9ml无菌水中摇匀 同法 依次稀释至10 6C平板制作将10套无菌培养皿编号10 410 510 6按次序分别取0 5ml菌液于相应培养皿 吸前移液管吹使其混匀 同时加热琼脂培养基 熔化 冷至45oC时 注10 15ml入培养皿 立即盖盖 混匀 冷却后即成平板 将培养基倒置于30恒温箱中培养 48h后观察结果 2 平板划线分离法a制作 将熔化冰冷至50oC的营养琼脂培养基10 15ml导入无菌培养皿 凝固成平板b划线 以无菌操作 接种环挑污泥于在平板上划线 盖盖 倒置于30oC恒温箱培养48h后观察结果2其他接种方法的操作1 斜面接种技术A贴标签B点燃酒精灯C将一支斜面菌种和一支待接种的斜面培养基放左手 拇指压住两试管 中指于其间 斜面向上 管口齐平 D接种环灭菌 E将棉花拔出 试管口微绕火焰 用接种环迅速移菌种于另一试管底部 再接种环上有底部向上画曲线 接种环灭菌 2 液体接种由斜面基接种到液体培养基 用接种环将菌种全送入液体培养基 塞棉花 转动使其混匀 3 液体培养基中的菌种被接入液体培养基用无菌移液管自菌种管吸取菌液接种到另一液体培养基中赛好棉塞即可4 穿刺接种将斜面培养基接种到固体或半固体深层培养基自中心刺入 直到管底 但不穿透 并沿穿刺途径拔出 易于观察 实验七纯培养菌中的菌体 菌落形态观察 一目的观察菌形态及菌落特征 通过革氏染色了解活性污泥有哪些微生物组成 二仪器材料三试验内容与方法1菌落形态和菌体染色及其形态观察A接种斜面培养基B菌落形态特征观察酵母菌菌落圆形 大小接近细菌 光滑 质地软 多为白色和红色 放线菌洛硬度大 干致密 与基质结合紧 酶菌菌落呈绒状或棉状 能扩散生长 疏松 在液体培养基上观察混浊度 有无沉淀 液体表面生膜与否 膜的形状等 在斜面培养基上 观察菌落生长旺盛程度 形状 颜色 及光泽等在穿刺接种时看菌落在基质表面的情况 菌落的延伸及是否液化培养基和液化情况 观察时绘出菌落形态特征图3 微生物个体形态观察观察的各种微生物菌落形态后 革氏染色 镜检 绘其形态图 2细菌 放线菌 酵母菌及霉菌菌落特征比较四实验报告五思考题 实验八水中大肠菌群的检测 目的学习水中大肠菌群的检测原理和方法仪器和材料样品培养基染料其他原理操作方法与步骤多管发酵法滤膜法 大肠菌系以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌 在世界范围内370c生长时 能于48h内发酵乳糖使产酸产气 主要包括埃希氏菌属 肠杆菌属 克雷伯氏菌属等 由于其在水体中存在的数目与肠道致病菌呈一定的正相关 抵抗力也略强 且易于检验等特点 在水质检测中常将其作为水体受粪便污染的指标 如我国生活饮用水卫生标准中即规定1L水样中大肠菌群数不超过3个 大肠菌群也称为粪便污染指示菌 苏检验方法有我管发酵法及滤膜法两种 多管发酵法可适用于多种水样 实验周期较长 滤膜法则适用于杂技较少的水样 特别适用于自来水厂作为常规监测之用 取水样自来水样的采集河湖 井水 海水水样的采集水样的处置初步发酵实验复发酵实验 准备工作滤膜灭菌滤膜过滤器安装过滤水样观察结果挑取符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色 镜检 将镜检验员革兰氏服性 无芽孢杆菌的菌落再接种一支乳糖蛋白胨发酵管 经370c培养24h 产酸又产气者即为大肠菌群阳性计算1L水样中的大肠菌群数 个 L 实验九水中细菌总数的测定 目的学习水中细