药学分子生物学实验指导书.doc

基因工程综合实验 武汉科技大学医学院生化教研室目 录分子生物学实验综合规程3参考书目 3实验内容4实验一 实验基础知识和基本技能培训5实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备7实验三 质粒DNA的转化8实验四 碱裂解法提取质粒DNA9实验五PCR基因扩增11实验六DNA的限制性核酸内切酶消化13实验七琼脂糖凝胶电泳检测DNA15分子生物学实验综合规程p 上课时间提前5分钟进入实验室；不迟到、不早退，无故旷课累计3次没成绩；p 请假须医院病假条或班主任签字的假条；p 上课时需穿实验服，不许在实验室内吃东西，不背着书包做实验，不穿拖鞋进实验室；p 实验课期间不许打闹、闲聊等，不大声喧哗，保持课堂纪律，实验过程中，至始至终需全组同学一起完成，任何人中途不得缺席。p 必须做到课前认真预习，课间做好实验记录、课后详细总结实验结果并按时提交实验报告；p 公用试剂不得污染！每次都必须用新枪头。公用台上公用试剂不得私自拿到自己实验台上；p 不得私自拿走或乱放别人的实验物品、实验产品；p 不得擅自使用实验室中非本实验仪器、试剂。p 实验废液不随便倾倒，随时保持实验台的整洁；p 爱护实验器材，实验器材损坏必须按规定赔偿；p 实验前按仪器性能与要求，进行仪器预热；p 实验完成后检查电源插座，用完仪器后必须复位，仪器清洁干净 、摆放整齐；每组实验物品齐全，需教师验收，枪量程要归位，发现问题及时报修；p 每位同学负责自己实验台面和柜体的卫生，值日生负责公用实验台、地面等处卫生；p 每次轮到打扫卫生的小组，要认真做好值日工作，离开实验室须向教师声明；p 同学与老师之间、同学与同学之间、实验班与实验班之间一定要互相协作配合保持公用房间卫生，注意门窗水电的安全。p 遵守通用的实验室规则。违反上述任何一条规则责任自负，并要扣分，造成损失要照价赔偿。参考书目：分子生物学实验指导，魏群 主编，高教出版社分子生物学实验指导，刘进元 主编，清华大学出版社实 验 内 容实验一 分子生物学实验的基本知识和基本技能培训实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备实验三 质粒DNA的转化实验四 碱裂解法提取质粒DNA实验五PCR基因扩增实验六DNA的限制性核酸内切酶消化实验七 琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验一 实验基础知识和基本技能培训实验目的 学习和掌握分子生物学实验的基本技术和技能，了解分子生物学实验中常用的仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。实验原理 通过多媒体、胶片、板书、实物演示等各种教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用玻璃器皿、耗材。1. 分子生物学实验综合规程（见前页）2. 分子生物学实验设备1) 温度控制系统：冰箱：4 、-20、-70 -样品、试剂和材料等的保存2) 恒温培养箱：细菌平板的培养3) 恒温空气摇床；菌体的培养4) 灭菌器: 培养基、试剂、耗材等的灭菌5) PCR仪：PCR 扩增、保温实验等6) 恒温水浴及微量加热器：保证实验温度的恒定7) 电泳仪：电泳时提供电压和电流8) 电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架9) 凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析10) 紫外分析仪：电泳结果的定性分析11) 台式高速冷冻离心机：样品的分离12) 分光光度计：样品的定量测定13) 超净工作台：提供洁净工作环境14) 电子天平：样品、试剂等的称量15) pH 计：精确的pH值测定16) 移液器；液体试剂的精确取量17) 制冰机：保证操作过程中温度的恒定3. 分子生物学基本技术3.1实验规范训练仪器的操作要求：a) 仪器在未经培训前，不得擅自使用b) 严格按操作规程使用仪器，c) 有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作d) 违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担3.2实验规范训练量程的选择1) 天平2) 烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶不同规格3) 量程的选择移液器3.3实验规范训练标签1) 所用的器皿上一定要做标记2) 标签一定要贴到固定的位置3) 标签上应包括具体的名称、组别、实验班、日期3.4实验规范实验操作1) 详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告2) 实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么3) 仔细操作和观察4) 保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉4 实验准备4.1 清点和熟悉常用玻璃器皿、耗材等4.2 洗涤本学期实验用玻璃器皿4.3 配制试剂1) 0.1 mol/L CaCl2 100 mL2) 5 mol/L NaOH 100 mL 胶塞3) LB液体培养基 100 mL 胰蛋白胨（typtone) 1g 酵母提取物（yeast extract) 0.5g NaCl 1g 加部分水溶解后加20L 5 mol/L NaOH，定容到100 mL（40 mL到两个250mL锥形瓶，3 mL分别到大试管中，用于预培养及复苏）4) 10%(w/v)SDS储液 50 mL，室温保存5) 1 mol/L Tris 200 mL6) 2 mol/L HCL 100 mL7) 0.5 mol/L EDTA 100 mL 80 mL水中加18.61g EDTA-Na2H2O，用NaOH调 pH 8（约需2g NaOH），后定容至100 mL8) 5xTAE 1000 mL9) 70%乙醇 500 mL10) Amp ：100 mg/ mL 20ml，分装每管 1 mL，20保存注意：先将所需烧杯、量筒、玻棒、双蒸水、微量离心管灭菌待温度降到室温后，在超净台中配制，再用一次性滤器过滤分装于1.5 mL无菌微量离心管中，20保存4.4 高温灭菌1) LB液体培养基 2) 1.5mL离心管 2瓶/组3) 枪头/1组 ： 1mL 1盒，200uL 1盒4) 培养皿 12套/组 5) 无菌水 100 mL /班 6) 0.1 mol/L CaCl2实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的 制备出感受态细胞。实验原理 感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。一、材料 大肠杆菌 E.coli DH5，100ml三角瓶，1.5ml 离心管(又称eppendorf管), 离心管架，1000 ul 、200ul枪头，大量冰块，二、设备 微量移液器(200l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，恒温摇床、冷冻离心机, 超净工作台, 紫外光度计，双蒸水器，冰箱等。三、试剂准备1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10 g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5, 加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 3、高压灭菌的0.1mo1L CaCl2：母液1M CaCl2 147 g CaCl2 2H2O，加水到1L4、高压灭菌过的30甘油四 操作步骤 大肠杆菌感受态细胞的制备（1） （已预先准备好）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落（超净工作台操作），接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1：1001：50转接于20ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养；（2） 取培养液1.5ml转入微量离心管中，在冰上冷却10min，于4，5000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）。（3） 倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴，04，5000rmin离心10min；（4） 弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，5000rmin离心10min；（5） 弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；（6） 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后在超净工作台分装到Eppendorf微量离心管中，液氮速冻后，置于-70条件下，可保存半年至一年。实验三 质粒DNA的转化实验目的 把DNA引入感受态受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。实验原理 受体细胞经过一些特殊方法如化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(即带有异源DNA分子的受体细胞)。CaCl2法的基本原理：细菌处于0，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面，经短时间42热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Ampr）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，可获得细菌菌落。 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 一、材料 IL-18质粒，大肠杆菌感受态，1.5ml塑料离心管，离心管架，1000 ul、200ul、20ul枪头，9cm培养皿，一次性滤膜（0.22um），大量碎冰二、设备 微量移液器(2l,200l,1000l)，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，培养箱，恒温水浴锅，恒温摇床，离心机 超净工作台，双蒸水器，冰箱等。三、试剂准备 LB固体培养基LB液体培养基氨苄青霉素（apm）：无菌水配置成100mg/ml溶液，用滤膜抽滤，-20保存灭菌双蒸水ddH2O四 实验操作（1） 平板的制备：LB固体培养基中加入Amp (100g/ml)，转化反应前一天，倒置平板，保存。（2） 分别用2个100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：第一组，质粒DNA组：2 l IL-18质粒DNA +100 l感受态细胞悬液第二组，空白对照组，2ul无菌水100l感受态细胞悬液（3） 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置15 min，于42水浴中保温90s，然后迅速冰上冷却2-5 min（4） 立即向上述管中分别加入0.9ml LB液体培养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总体积到1ml，摇匀后于37振荡培养约60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。（5） 在超净工作台取各样品培养液0.1ml在平板上涂布，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上（做好标记，日期），涂匀。（6） 培养皿正置于37培养箱中2h，待菌液完全被培养基吸收后，倒置过夜(12-16小时)。（7） 观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养， 置于4条件保存待用。注意事项 1. 加入质粒后要轻轻混匀，动作一定要轻柔。2. 42热激时间一定不能超过90s。思考题1、制备感受态细胞的原理是什么？2、可将外源基因转化受体细胞的方法有哪些？实验四 碱裂解法提取质粒DNA实验目的 1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法；2、了解制备原理及各种试剂的作用。实验原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。） 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 一、材料 含IL-18质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、吸水纸。 二、设备 微量移液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。三、试剂准备1、 LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20保存备用。 3. 溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121高压灭菌15min ，贮存于4。4. 溶液：0.2M NaOH，1% SDS。配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。5. 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备用。6. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 7. 无水乙醇；8. 70%乙醇；9. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121高压湿热灭菌20min，4保存备用。1M Tris Cl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800ml H2O中溶解 121g Tris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L； 0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O，用10M NaOH调 pH8.0(需约50ml)， 补H2O到 1L。10. RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20。四、操作步骤1 用灭菌牙签挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于5ml LB（含Amp 100ug/ml）液体培养基中，37、200rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。2 取1.5ml菌液置于1.5ml EP管中，15,000rpm离心30秒，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。3 加入100ul溶液，震荡悬菌，室温放置5分钟。4 加入200ul溶液，轻轻颠倒混匀5次，置冰浴5分钟。5 加入150ul溶液，颠倒混匀，置冰浴10分钟。此时，可见大量白色沉淀。6 15,000rpm离心5分钟，将上清400ul转移至另一干净的EP管中，弃沉淀。7 加入240ul异丙醇（0.6体积），混匀，置室温10分钟。8 15,000rpm离心10分钟，弃上清，控干。9 50ul TE溶解沉淀，加入50ul冰预冷的5M LiCl，混匀，置冰浴10分钟。10 15,000rpm离心10分钟，将上清100ul转移至另一干净的EP管中。11 等体积酚:氯仿:异戊醇抽提一次，氯仿:异戊醇抽提一次。（可不做）12 2倍体积-20预冷的无水乙醇，混匀，置-20沉淀10分钟。13 15,000rpm离心10分钟，弃上清。14 待乙醇挥发干净后，将沉淀溶于20ul TE(pH8.0，含20g /ml RnaseA，约4l)中，37水浴30min以降解RNA分子，储于-20冰箱中待用。注意事项 1. 溶液II必需新鲜配制。2. 严格控制碱变性的时间（即步骤4）的时间，使其不超过5分钟。因为，如质粒处于强碱性环境中时间过长，可发生不可逆变性。3. 在加入溶液III后，要充分混匀并迅速置于冰上。如未见大量白色沉淀，说明实验失败，立即重做。4. 弃上清时，必须控干，即除尽管内的液体。在做最后一步时，应尽量将乙醇挥发干净，可用滤纸条小心吸净离心管壁上的乙醇液滴以节省时间。5. 提取过程应尽量保持低温。思考题1、 裂解细菌时需注意的事项有哪些？2、 碱裂解法提取质粒DNA中溶液、的作用是什么？3、 简要说明作为基因工程的载体，质粒必须具备哪些特点。4、 简要说明质粒提取的3个步骤及其原理。实验五 PCR基因扩增实验目的 1、掌握PCR基因扩增的方法；2、了解制备原理及应用。实验原理PCR反应（Polymerase Chain Reaction, 多聚合酶链式反应）：模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外有酶催化合成特异性DNA片段，为最常用的分子生物学技术之一。其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以几何级数倍增。其主要步骤是：1）将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93-94）使其变性解成单链；2）人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；3）耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72将单核苷酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从53方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR反应体系组成包括：DNA模板，4种dNTP，两条引物，Taq酶和Taq酶的缓冲液。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低的特点，使得PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于各个领域：1) 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等；2) 遗传病的产前诊断；3) 致病病原体的检测；4) 癌基因的检测和诊断；5) DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；6) 动、植物检疫；7) 在转基因动植物中检查植入基因的存在。一、试剂准备根据目的基因序列，合成两条（10M）的引物：引物1(正向序列)：引物2(反向序列)：10-100ng/ul DNA模板 10PCR Buffer 20mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各20mMTaq酶 1U/ul灭菌双蒸水ddH2O琼脂糖二 设备PCR仪，灭菌锅，双蒸水器，离心机，冰箱，紫外分析仪，移液器(2ul, 20)，枪头200ul，20ul，一次性手套， 0.2ml离心管及架，冰块，三、操作步骤1取0.2 ml灭菌PCR管1只。2如下建立20 ul PCR反应体系，依次加入各组分，分别点在PCR管壁的不同部位：灭菌双蒸馏水15 l10 Taq DNA聚合酶缓冲液 2 ldNTP (2.5 mM /each) 1 lPrimer1（10 mM）0.3 l Primer2（10 mM）0.3 l模板 1 l轻弹管壁以混匀各组分，离心数秒Taq DNA聚合酶 0.5 l轻弹管壁以混匀，再离心数秒，3如下进行PCR扩增反应：94 ，5 min1 cycle94 ，30 sec60 ，30 sec25 cycles72 ，1 min72 ，10 min1 cycle4扩增产物保存于4待用。四、注意事项1聚合酶缓冲液从低温取出后要充分溶解并混匀，冷冻会使缓冲液形成浓度梯度。2Mg2+浓度过高，产物特异性差；过低，产物得率低。3dNTP浓度过高，反应速度快，但碱基错配率高，成本也高；过低则反应速度慢。4引物浓度若过高，会引起错配和非特异性产物的扩增及二聚体的产生。5为防止污染，应设阴性对照（除无模板外，其它同样品管）。6退火温度一般在40 60 之间，退火时间在30 sec左右。引物长度为1525 bp时，退火温度Tm = 4(G+C) +2(A+T)；允许范围内，Tm越高，特异性也越高。7扩增片段大小1 kb，则需适当延长时间。8扩增反应结束后，一般需在72 下再延伸10 min。9循环次数理论上进行2025次即可，但实际操作中进行2530个循环较佳。思考题1、PCR的原理是什么？2、PCR反应体系包括哪些组分？1. 简述PCR的基本原理和注意事项。2. 如何预防PCR出现假阳性结果?实验六 DNA的限制性核酸内切酶消化实验目的 1. 熟记限制性核酸内切酶在基因工程中的应用。2. 掌握利用限制性核酸内切酶切割DNA的基本方法。实验原理限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA中特定核苷酸序列，并能在识别位点或其附近切割DNA双链的一类核酸水解酶。其种类繁多、主要从原核生物中分离得到。此类酶的发现及应用，对现代分子生物学的发展起到了重大的推动作用。限制性核酸内切酶可分为I、II、III三类。其中，I类和III类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的限制（切割）活性。III类限制酶只在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离；而I类限制酶结合位点与切割部位不一致，没有固定的切割位点，故I类和III类限制酶在分子生物学实验中不常用。II类限制酶是由两种酶分子组成的二元系统：一是限制性内切酶，它能识别双链DNA的特异序列并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片断；另一类是独立的甲基化酶，它和同类限制酶识别相同序列，但发挥不同作用（甲基化作用），如：EcoR I限制酶和EcoR I甲基化酶可识别同一序列，但作用各不相同（前者切割，后者甲基化）。II类限制酶的识别序列为反向重复序列（回文结构或二重对称结构），具有180旋转对称性，长度约为4、5、6个碱基（少数酶识别更长的序列或兼并序列），富含GC。限制性核酸内切酶切割DNA双链后，可产生3种切口。平端切口：限制酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链产生的末端；5突出的粘端切口：限制酶在二重对称轴的5端切割DNA每条链，使双链DNA交错断开而产生的末端；3突出的粘端切口：限制酶在二重对称轴的3端切割DNA每条链，使双链DNA交错断开而产生的末端。限制性内切酶的活性单位U为：特定条件下，1小时内在50 ul体系中酶解1ug DNA(噬菌体DNA)所需要的酶量。通常，利用质粒的大小和限制性酶切位点来鉴定质粒。具体做法是：首先，选用一种或两种限制性核酸内切酶切割质粒；然后，进行琼脂糖凝胶电泳；最后，根据DNA片断的电泳迁移率和酶切图谱对质粒进行鉴定。一、试剂1、 限制性核酸内切酶EcoR I，Hind III及其相应的缓冲液2、 灭菌蒸馏水3、 实验八提取的高纯度质粒二、设备 微量移液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。三、操作步骤1取1.5ml灭菌EP管1只。2建立15ul酶切反应体系，分别加入：灭菌蒸馏水： 10ul10*Buffer R： 1.5ul；质粒DNA： 3ul EcoR I： 0.3ul；Hind III： 0.3ul混匀，6000rpm，离心10秒。337 水浴2小时。四、注意事项1内切酶：内切酶从冰箱取出后应置于冰上，用后迅速放回冰箱。一般最后加内切酶，每次取酶须更换新的吸头。2DNA：要有一定的纯度（不能含有迹量酚、氯仿、EDTA、SDS等）。3酶解温度和时间：酶解温度一般为37。酶解时间可根据加入酶量而定，酶量多则时间可较短；相反酶量少可通过延长时间来达到完全酶解DNA的目的。4酶解容积：一般50ul，可随需酶切的DNA量的多少而增减；一般加入内切酶的容积不能超过总体积的1/10，否则，甘油浓度过高会抑制内切酶的活性。5混匀：可用移液枪吹打或手指轻弹管壁混匀，对于大分子DNA则操作必须轻柔，混匀后作短暂离心。6反应终止：若以后不再进行酶促反应，则加入EDTA至终浓度为10mmol/L。若以后还要进行酶促反应（如连接），则可于65保温20min，但此法灭活可能并不完全。用酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。7酶解结果鉴定：酶解完成后，不必立即终止反应，可先取出适量反应液进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果后再决定是否终止反应。五、思考题1限制性核酸内切酶切割DNA双链后，可产生哪些切口，各有何特点？2简述限制性核酸内切酶消化DNA时的注意事项。实验七 琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验目的 本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA含量与分子量。实验原理 根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显色。琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。1） 在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖一磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。2） 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。3） 溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。不同构型的DNA分子，其电泳迁移率也是不同的。我们所提取的质粒往往有三种构型：超螺旋环状、线状和带切口环状。电泳时，由于三者的空间构象紧密程度不同，所以，它们的迁移率并不相同。一般情况下，具有超螺旋构型的质粒，由于其结构最为紧密，所以它的迁移率也就最大，跑在最前面；其次为具有线性构型的质粒，具有带切口环状构型的质粒跑在最后。质粒经限制性核酸内切酶切割后，其构型均为线性，其电泳迁移率主要取决于分子量大小。质粒DNA样品中