食品过敏原大豆成分LAMP实时浊度检测法的建立.docx

食品过敏原大豆成分LAMP实时浊度检测法的建立邝筱珊，成晓维，游淑珠，王小玉，刘李登，冯家望*（珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东珠海 519015）摘 要 ：根据过敏原大豆的保守内源基因Lectin的序列，设计6条特异性LAMP引物，利用实时浊度仪对反应体系中扩增产物的实时监控筛选出最佳引物，建立食品中过敏原大豆成分的环介导等温扩增（LAMP）检测方法，并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价。结果表明：该方法能够特异性检出食品中的过敏原大豆成分，特异性高，灵敏度 达0.1%（w/w）。对含有大豆成分为10%、1%、0.1%、0%（w/w）的样品分别进行20次重复实验，其稳定性好，假阳性和假阴 性率为0%。本实验建立的LAMP方法适用于特异性快速检测食品中的过敏原大豆成分。关 键 词 ：环节导等温扩增法（LAMP），实时浊度仪，过敏原，大豆，检测Development of a real-time turbidimeter-based LAMP method fordetection of allergen soybean in foodKUANG Xiao-shan，CHENG Xiao-wei，YOU Shu-zhu，WANG Xiao-yu，LIU Li-deng，FENG Jia-wang*（The Inspection Technical Center of Zhuhai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhuhai 519015，China）Abstract：According to the endogenous gene of allergen soybean Lectin ， six specific LAMP primers weredesigned. A loop-mediated isothermal amplification（LAMP） method for detecting allergen soybean in food was established. Real-time monitoring of the LAMP reaction was achieved by a turbidimeter. Specificity，sensitivity， stability and repeatability of this method were tested. The results showed that the method could specifically detect the soybean in food，and the detection sensitivity of the method was 0.1% （w/w）. With the soybean sample of 10%，1%，0.1%，0%（w/w） concentration as templates，stability and repeatability testing was conducted， false negative rate was 0% . The results showed that the LAMP method is suitable for specifically detecting allergen soybean in food.Key words：loop-mediated isothermal amplification（LAMP）；real-time turbidimeter；allergen；soybean；detection中 图 分 类 号 ：Q78文 献 标 识 码 ：A文 章编号 ：1002-0306（2014）22-0065-05doi：10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.005食物过敏是人的机体对外源物质（过敏原）产生的一种常见变态反应。在过去的20年里，食物过敏的 发病率显著上升，过敏原己成为食品安全隐患之一1。 各国政府和国际组织非常重视这个问题，先后通过 严密的科学调查和理发论证，相继修改和出台规范 食品中过敏物质标识的法律方案，对食品标签上过 敏原成分的标注作出严格规定，尤其是欧美、日本等 发达国家2。我国的国家标准GB7718-2011预包装 食品标签通则也推荐标识大豆等常见致敏物质。大 豆作为含有丰富蛋白质的豆科植物，由于其丰富的 营养特性和功能属性被广泛应用于配方食物、肉类和家禽类产品、面包点心、乳制品和各种可食用产品中。据报道，有90%的食物过敏情况都是由八大类食品造成的，而大豆就是其中之一3。大豆过敏患者在摄食大豆及其制品或者吸入大豆粉末时可能出现恶心、呕吐、舌咽肿、嘴唇红肿、口腔疼痛和一些肠道 疾病等临床症状，严重的会导致休克甚至死亡4。关 于食用大豆后过敏致死的事件已有报道5。目前，对食物过敏最有效最直接的治疗手段是避免食用含有过敏原的食物，因此大豆过敏原检测 技术对大豆过敏患者的安全消费意义重大。食物过 敏原检测方法既可以基于蛋白，也可以基于DNA6-8。 前者包括电泳法9、色谱法、质谱法和免疫学方法，如 酶联免疫吸附实验（ELISA）10、放射过敏原吸收抑制收 稿 日 期 ：20140210作 者 简 介 ：邝筱珊（1982-），女，硕士研究生，工程师，研究方向：食品 安全检测。* 通 讯 作 者 ：冯家望（1965-），男，硕士研究生，研究员，研究方向：食 品安全检测。基 金 项 目 ：国家质检总局科技计划项目（2011IK255）。实验 、免疫印迹 和免疫扩散及各种试剂盒等；后1112者主要采用各种PCR方法，如实时荧光定量PCR、多重PCR等13-15。也有新型技术如生物传感器16、生物芯片技术17等方法。环介导等温扩增技术（loop mediatedisothermal amplification，LAMP）是Notami等开发的一65 2014年 第22期分 析 检 测Science and Technology of Food Industry种简单快速、特异性强的体外恒温扩增方法18。该方法针对靶基因的6个区域设计4条特异的引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件保温条件下完成核酸 扩增反应，通过观察副产物焦磷酸镁沉淀的浊度或者显色反应即可判定结果。无需昂贵的仪器设备，具 有耗时、操作简单的优势，更适合基层的推广应用。 本研究采用LAMP实时浊度法对食品中过敏原大豆成分进行检测，为食品的风险评估、加工、管理及过 敏原成分的标识提供可靠的技术保障。含F1c（与Fl区域互补）和F2序列，内引物BIP包含B1c（与B1区域互补）和B2序列，外引物为F3和B3序列， 本研究在内外引物的基础上引入环引物FLP和BLP。 引入环引物后，当第一阶段的哑铃状茎环结构形成， 环引物能与其结合并引导扩增。即引入环引物后，自 主扩增增加了两个位点，加快扩增进程，大大缩短了 反应时间。引物序列见表1。1.2.2 样品DNA提取 将待测样品用洁净研钵或粉碎装置充分研磨混匀，食品样品的取样部位尽可能 覆盖其各种原料成分。称取1g样品进行DNA提取， DNA提取步骤按试剂盒的说明书进行，所提取的DNA 经紫外分光光度计检测浓度并稀释至100ng/L，于-20保存备用。1.2.3 LAMP扩增反应 反应总体积为25L，包括10Thermol Buffer 2.5L、内引物FIP和BIP（40mol/L）各1.0L、外引物F3和B3（10mol/L）各0.5L、FLP和BLP（20mol/L）各 1.0L、dNTPs（10mmol/L）4.0L、甜 菜碱（5mol/L）5.0L、硫 酸 镁（150mmol/L）1.0L、BstDNA聚合酶（8U/L）1.0L、模板DNA（约100ng/L ）2.0L，用灭菌去离子水补齐到25.0L，充分混匀。实 时浊度仪63恒温反应1h，最后80灭活5min结束反应。1.2.4 特异性实验 利用建立的LAMP实时浊度法，分别以大豆、四季豆、羽扇豆、鹰嘴豆、荷兰豆、豌豆、 扁豆、豇豆、蚕豆、红豆、绿豆、燕麦、荞麦、黑麦、小 麦、大麦、花生、芝麻、鸡肉、鱼肉、牛肉、鹅肉、鸭肉、 羊肉、猪肉、虾肉、蟹肉、扇贝、胡萝卜、芹菜、核桃的 DNA作为LAMP反应模板，以ddH2O为空白对照，进行 LAMP反应，以评价该方法的特异性。1.2.5 灵敏度实验 用研磨机将大豆和小麦磨成粉 末状，并60烘干6h。用小麦粉配成大豆粉含量为10% 、5% 、1% 、0.5% 、0.1% 、0.05% 和0.01%（W/W）的 混合样品，以小麦粉为阴性对照，用于过敏原大豆成 分的重量比灵敏度测试。1.2.6 稳定性实验 利用建立的LAMP实时浊度法， 对大豆含量为10%、1%、0.1%、0%（w/w）4个不同浓度 的样品分别进行20次重复扩增，以评价该方法的稳 定性。1.3数据处理利用实时浊度仪的LA-320CE软件分析扩增反 应，横坐标为扩增时间，纵坐标为浊度值，产生浊度 曲线表明发生扩增反应，并筛选浊度出峰时间早，峰值较高的引物为反应引物。材料与方法11.1材料与仪器大豆、四季豆、羽扇豆、鹰嘴豆、荷兰豆、豌豆、扁 豆、豇豆、蚕豆、红豆、绿豆、燕麦、荞麦、黑麦、小麦、 大麦、花生、芝麻、鸡肉、鱼肉、牛肉、鹅肉、鸭肉、羊 肉、猪肉、虾肉、蟹肉、扇贝、胡萝卜、芹菜、核桃 购 于珠海超市或实验室自留样；食品样品 购于珠海超 市 ；DNA 提 取 试 剂 盒 Biosprint 15 DNA plant kit QIAGEN 公司；Bst DNA polymerase large fragment New England Biolabs 公 司 ；甜 菜 碱（Betaine） 10 Thermol Buffer，Sigma公司；dNTPs宝生物工程（大 连）有限公司；LAMP引物宝生物工程（大连）有限 公司。LA-320C型LAMP实时浊度仪日本荣研化学株式会社；NanoDrop型紫外分光光度计司；PCR仪7500Fast型实时荧光定量1.2实验方法美国Thermo公美国ABI公司。1.2.1 LAMP引物设计 6065是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65左右处于动态平衡状 态，任何一条引物与双链DNA的互补部位进行碱基 互补配对延伸的时候，另一条链就会脱落变成单链。LAMP方法正是利用这一特点进行反应的。利用4条 特异性引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使 得链置换DNA的合成在不停的自我循环19。LAMP反 应阶段，随着反应的进行，dNTP会释放出焦磷酸根离子，焦磷酸根离子遇到Mg2+会生成焦磷酸镁白色沉 淀，而实时浊度仪每6s自动对每个反应管的浊度进 行测定，可实时监控扩增反应中沉淀物的增加。根据 LAMP引物设计的原则，在NCBI网站中查找Lectin基因相关序列，利用DNAMAN软件对查到的各序列进 行比对，使用在线设计软件Primer Explorer version4 和LAMP Designer软件设计特异引物，设计多套LAMP 引物。利用实时浊度仪对反应体系中扩增产物的实时监控筛选出最佳引物。共6条分别为内引物FIP包表1 LAMP引物序列Table 1LAMP primers sequence引物名称序列信息F3B3FIP（F1c+F2） BIP（B1c+B2） FLPBLPGCCGAAGCAACCAAACATGGGGGCATAGAAGGTGAAGTT TGGGGTGCCGTTTTCGTCAACGAGACGCTATTGTGACCTCC CTCTACTCCACCCCCATCCACAAAGGAAGCGGCGAAGCT TGAGTTGTAACTTTCCCGAGACAAAGAAACCGGTAGCG66 2014年 第22期分 析 检 测Vol . 35 , No . 22 , 2014结果与分析0.252ACH1CH2CH3CH4CH5CH6CH7CH82.1 LAMP引物筛选结果用大豆DNA 作为阳性模板进行引物的初步筛 选，在所设计的多套引物中，选择发生了扩增反应， 且出峰时间较早，峰高值较高的一套引物。该套引物出峰时间为45min左右，峰高为0.16（见图1）。对该套 引物引入环引物进行优化，引入环引物后，出峰时间 提前至22min左右（见图2）。0.200.15CH10.100.050-0.050009001800时间（min）270036000.250.200.150.100.050CH1CH2CH3CH40.250.200.150.100.050BCH1CH2CH3CH4CH5CH6CH7CH8CH3CH4-0.0500018003600时间（min）54007200-0.050009001800时间（min）27003600图1 LAMP引物筛选结果Fig.1 Result of primers screening test of LAMP注：CH12：空白对照（ddH2O），CH34：大豆；图2同。0.25CCH1CH2CH3CH4CH5CH6CH7CH80.200.150.100.0500.25CH1CH2CH3CH40.20CH40.15CH30.10-0.050009001800时间（min）270036000.0500.250.200.150.100.050DCH1CH2CH3CH4CH5CH6CH7CH8-0.050009001800时间（min）27003600图2引入环引物的LAMP引物实验结果Fig.2 Result of LAMP primers with ring2.2特异性实验结果利用建立的LAMP实时浊度法，对31种成分进行 检测。结果显示，除大豆出现了阳性扩增外，其余30 种成分均未发生扩增。实验表明该LAMP引物具有特 异性（见图3）。-0.050009001800时间（min）27003600图3LAMP实时浊度法特异性实验结果Fig.3 Results of specificity test by real-time turbidimeter-based LAMP 注：A：CH1CH8：大豆、四季豆、羽扇豆、鹰嘴豆、荷兰豆、豌 豆、扁豆、空白对照（ddH2O）；B：CH1CH8：豇豆、蚕豆、红豆、 绿豆、燕麦、荞麦、黑麦、小麦；C：CH1CH8：大麦、花生、芝麻、 鸡肉、鱼肉、牛肉、鹅肉、鸭肉；D：CH1CH8：羊肉、猪肉、虾肉、 蟹肉、扇贝、胡萝卜、芹菜、核桃。灵敏度实验结果利用建立的LAMP 实时浊度法，对大豆含量为10%、5%、1%、0.5% 、0.1% 、0.05% 、0.01%（w/w）的样 品进行检测，含量为10%、5%、1%、0.5%、0.1%的样品 均发生了扩增反应，含量为0.05%、0.01%及阴性对照 小麦粉样品未发生扩增反应（见图4），实验表明，该 方法检测大豆过敏原成分的灵敏度为0.1%（w/w）。2.4 稳定性实验结果利用建立的LAMP 实时浊度法，对大豆含量为10%、1%、0.1%、0%（w/w）的4个样品分别进行20次重 复实验，假阳性率和假阴性率为0%，表明本实验建 立的LAMP实时浊度法对过敏原大豆成分的检测具 有良好的稳定性。2.32.5实际样品检测从超市收集大豆加工产品38份以及不含大豆成 分的样品22份。用本实验建立的LAMP实时浊度法对 这60个样品进行检测，并与荧光PCR法的结果进行 比较，评价该方法的实际应用价值，实验结果见表3。 实时荧光PCR法根据SN/T 1961.19-2013进行。67 2014年 第22期峰高值峰高值峰高值峰高值峰高值峰高值分 析 检 测ScienceandTechnologyofFoodIndustry0.25反应从1h内进一步缩短至30min内。该方法的灵敏度为0.1%（w/w）。对4个不同质量浓度的大豆样品分别进行20次重复实验，假阳性率及假阴性率为0%。对31种成分的测试中仅有大豆成分出现阳性扩增，其他成分均无出现扩增。对60个实际样品的检测结果 与荧光PCR法的结果一致，并与预期相符，表明该方 法具有良好的稳定性和特异性，适用于食品中过敏 原大豆成分的快速检测。参考文献CH1CH2CH3CH4CH5CH6CH7CH8CH40.20CH3CH1CH6CH50.150.100.050-0.050009001800时间（min）27003600图4 LAMP实时浊度法灵敏度实验结果Fig.4 Results of sensitivity test by real-time turbidimeter- based LAMP注：CH1：10%；CH2：阴性对照（小麦粉）；CH3：5%；CH4：1%；CH5：0.5%；CH6：0.1%；CH7：0.05%；CH8：0.01%。表2 实际样品检测Table 2 Test results of commercial samples1 孟伟帅，关荣发，任骏恩，等. 食品过敏原检测技术的研究J. 广东化工，2010，37（4）：167-168.2 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Sensitive（下转第72页）大豆含量（%，w/w）假阳性率（%）假阴性率（%）阳性样品数/实验数1010.1020/2020/2020/200/2000000000表3 实际样品检测Table 3 Test results of commercial samples含大豆成分 不含大豆 与荧光PCR法 与标签标识样品样品数成分样品数结果不符数不符合数豆腐豆浆 豆奶 腐竹 豆干 蛋糕粉 面包 饼干 面条 调味品 麦片膨化食品555553124021000002431534000000000000000000000000在实际样品检测中，荧光PCR法的Ct值及LAMP实时浊度法的峰值拐点时间与样品中过敏原大豆成 分的含量成正比关系。上述样品的检测中，荧光PCR 法的Ct值出现在5070min，而LAMP实时浊度法的峰 值拐点则出现在1830min，LAMP实时浊度法的检测时间明显比荧光PCR法的检测时间短。并且在实际 应用中，LAMP法仅需在简单的恒温设备中进行，以 肉眼观察反应管中产生的白色沉淀判断结果，操作 简便，成本低，更适合基层实验室甚至现场实验。结论本研究建立了食品中过敏原大豆成分的LAMP实时浊度检测方法，引入环引物的LAMP引物使扩增368 2014年 第22期峰高值分 析 检 测Science and TechnologyofFood Industry增加判定的准确度。可应用于其他复杂样品挥发性成分的检测中，以提高定性鉴别的准确度和可信度。参考文献1 赵煜，朱刚，于长青，等. 超临界CO2萃取当归油的工艺及当 归多糖的提取J. 中国中医药信息杂志，2004，11（6）：512-513. 2 黄伟晖，宋纯清. 当归的化学和药理学研究进展J. 中国中 药杂志，2001，26（3）：147-151.3 杜俊蓉，白波，余彦，等. 当归挥发油研究进展J. 中国中药 杂志，2005，30（18）：1400-1406.4 项妤，张贵君，甘德全. HPLC测定CO2超临界萃取的当归油药效组分J. 中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：64-65.5 李桂生，李八方. 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