工艺技术_发酵工艺学菌种选育知识课件

菌种选育是一门应用科学技术 理论基础 微生物学 微生物遗传学 生物化学 分子生物学 基因工程等学科 目的 菌种选育目的 生产 科研 青霉素生产菌种选育 1928年 Fleming 点青霉2U mL 1943年 一农妇的发霉甜瓜上分离到一株产黄青霉 120U mL 经诱变 WisQ176 900U mL 目前工业发酵水平 85000U mL 菌种选育的基本内容 根据菌种自然变异而进行的自然选育 用人工方法引起菌种变异或形成新的杂种 再按照工业生产的要求进行筛选来获的新的变种或杂种 包括诱变育种 杂交育种 原生质体育种 基因工程育种 自然选育概念 利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理 通过分离 筛选排除衰退型菌株 选择维持原有生产水平的菌株的纯种选育的方法 菌种为何会退化和变异 1 1菌种退化和变异的原因 总的来说 内因 外因遗传2 自发突变的结果可能原因 1 沙土管长期保藏2 连续传代3 新陈代谢产生的诱变物质4 增变基因 死亡基因的存在3 经诱变剂处理后的退化变异 生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液 分离出单菌落 1 2自然选育流程图 为何进行复筛 生产菌种斜面 制备单孢子悬浮液 分离出单菌落 自然选育是一种纯种选育的方法 优点 简单易行缺点 效率低 进展慢难以获得高产突变株以微生物的自然变异作为基础的生产选种机率并不很高 一个基因的自然突变频率仅10 6 10 10左右 目的 纯化 复壮菌种 2诱变育种2 1概念 以人工诱变手段诱发微生物基因突变 改变遗传结构和功能 通过筛选 从变异体中找出产量高 性状优良的突变株 并找出其最佳培养基和最佳培养条件 使其在最适的环境条件下合成有效产物 2 2优点 速度快 收效大 方法简单是当前的一种主要方法2 3理论基础 基因突变 诱发突变 诱发突变重要概念突变 由于染色体或基因本身的变化而产生遗传性状的变异 表型迟延 表型改变落后于基因型改变的现象 诱变过程 突变的诱发过程1 诱变剂接触DNA分子及对DNA分子的损伤2 DNA损伤的修复 五种方式3 从突变到突变型分离性延迟和生理性延迟可理解为 质 和 量 16 DNA损伤修复的五种方式光复活作用切补修复重组修复SOS修复系统DNA多聚酶的校正作用 有利于突变的发生 2 4诱变育种方案设计制定筛选目标诱发突变常用诱发剂及其特点诱变剂的选择不稳定菌株 温和诱变剂稳定菌株 强烈的 广谱的诱变剂低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性C 突变株的筛选 物理诱变剂紫外线 X 射线 射线 快中子特点 紫外线方便 有效 使用安全 其他的几种射线有一定的穿透力化学诱变剂碱基类似物 吖啶类 烷化剂特点 高效 经济 但应注意使用安全 各种诱变的机制 筛选 将分离培养后的各型单菌落接斜面培养 成熟后接入摇瓶 测定其发酵生产能力的过程 初筛 以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的 以量为主 复筛 则是精选 以质为主 也就是以精确度为主 2 5诱变育种步骤出发菌株的选择处理菌悬液的制备诱变处理中间培养分离和筛选 出发菌株的选择1 选择纯种2 平均发酵单位要高 且发酵单位的波动幅度要小 摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小 3 有良好的代谢特性 4 选择对诱变剂敏感的菌株 5 选用多个出发菌株进行诱变收效较快 诱变剂的选择野生型菌株 遗传性不稳定 用缓和的诱变剂 遗传性稳定的菌株 先要用强烈的不常用的诱变谱广的诱变剂处理 使其发生强烈的变异 然后再用缓和的诱变剂进行处理或多次自然分离 要考虑诱变剂的作用机理来选择诱变剂 两种诱变剂复合使用效果好 最适剂量 有2种观点 杀菌率90 99 较好 甚至99 9 杀菌率75 85 2 6突变株的筛选 Selection 随机筛选 Randomselection 摇瓶筛选法初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶 从大量菌株中选出10 20 较好的菌株 淘汰80 90 的菌株 而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶 并要重复3 5次 选出3 5个较好的菌株 再做进一步比较 选出最佳的菌株 复杂 耗时 琼脂块筛选法简单 快速 但不准确 自动化筛选 筛选几千个菌落数 天 理性化筛选又称定向筛选 Orientedselection 运用遗传学 生物化学的原理 根据产物已知的或可能的生物合成途径 代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法 以打破微生物原有的代谢调控机制 获得能大量形成产物的高产突变株 反馈 指反应链中某些中间代谢产物或终产物对该途径关键酶活性的影响 反馈抑制 指反应途径中某些中间产物或末端产物降低该途径中前面酶催化的反应速度 末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径 反馈阻遏 代谢的终产物达到一定浓度时 对该代谢途径前面的一种酶或几种酶的生物合成产生阻碍作用 普遍存在着反馈抑制和反馈阻遏 要打破反馈调节系统 可从两个方面着手 1 降低终产物浓度筛选细胞膜透性改变的突变株例如 谷氨酸发酵选育的高产菌株为谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型 2 初级代谢产物高产菌株的筛选 筛选营养缺陷型突变株营养缺陷型 诱变产生的缺乏合成某些营养物质的能力 须在基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株 野生型 与营养缺陷型对应的是野生型 渗漏缺陷型 是遗传性障碍不完全的营养缺陷型 突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失 能少量地合成某一代谢产物 基本培养基 MM 能满足野生型菌株正常生长的培养基minimalmedium补充培养基 SM 在基本培养基中加入相应的营养成分的培养基supplementalmedium完全培养基 CM 能满足各种营养缺陷型生长的称培养基CompleteMemum 筛选营养缺陷型的步骤 诱变淘汰野生型检出缺陷型确定生长谱 淘汰野生型 抗生素法 由于细菌或酵母对一些抗生素敏感 在MM中一定量的抗生素 杀死活化状态的野生型 保存了休眠状态的缺陷型细菌 青霉素 酵母 制霉菌素菌丝过滤法 对于霉菌 因孢子生长后会长出菌丝体 就可用滤纸过滤法将菌丝滤去 而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过 检出缺陷型 原理 在固体基本培养基和完全培养基上 生长情况完全不同 缺陷型在CM上生长良好 而在MM上则不生长 野生型都能生长 具体方法 影印法 点种法 夹层法 生长谱测定的方法 将缺陷型菌株培养后 收集菌体 制备成细胞悬液 与MM培养基 融化并凉至50 混合并倾注平皿 待凝固后 分别在平皿的5 6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片 培养后会在某组合区长出 就可测得所需营养 一个平皿测一个菌 以不同组合的营养混合物与融化凉至50 的MM培养基混合铺成平皿 然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置 培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子 在5 6个平皿上可测20株菌以上 2 筛选抗反馈调节突变株筛选结构类似物抗性突变株结构类似物 结构与代谢产物类似的化合物特点 有反馈调节作用无正常生理功能筛选方法 浓度梯度法 补充 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株 诱变育种实例 赖氨酸高产菌株选育 黄色短杆菌的代谢过程 抑制 黄色短杆菌的代谢特点天冬氨酸激酶 AK 是一个变构酶 并有两个活性中心 分别受Lys 赖氨酸 Thr 苏氨酸 的协同反馈抑制协同反馈抑制 该酶有多个活性中心 抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合 但是并不影响该酶的活性 只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后 其活性才受到抑制 两个分支点的优先合成机制 优先合成高丝氨酸Hos 再优先合成蛋氨酸Met当Met过量时阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶 使代谢流向合成Thr的方向进行当Thr过量时反馈抑制高丝氨酸脱氢酶 使代谢流向Lys的合成上 Met Thr Lys 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸 半醛 高丝氨酸 高丝氨酸磷酸 O 琥珀酸高丝氨酸 二氢吡啶 2 6 二羧酸 赖氨酸 苏氨酸 蛋氨酸 天冬氨酸 育种途径切断或减弱代谢支路切断或减弱合成Met Thr的分支途径 选育营养缺陷型突变株 可选用Hos 其意义在于 解除了Hos的优先合成机制 阻断了代谢向Met Thr的方向进行 节省了原料 可以使Asp 半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上 在培养基中限量的供给Met Thr 或者Hos 对于AK酶活性的调节有着重要意义 因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶 限制了其中某一个抑制物 Thr 则Lys的浓度再高 也不会影响到AK酶的活性 那么 代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行 使得产物的合成畅通无阻 双重营养缺陷型突变株 Met Thr 其本质和Hos 相同 优点 遗传性质稳定 回复突变的几率少 人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸 高丝氨酸脱氢酶 不能合成 可以大量积累 人工诱变的菌种不能产生 解除反馈调节 反馈阻抑 从理论上讲 选育Hom 进行赖氨酸发酵 如果在其培养基中限量供给Thr 则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制 实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用 因此 对于黄色短杆菌的Lys发酵 仅仅选育Hom 是不够的 为了高效率的转化Lys 需要解决这一问题 使该酶 AK 脱敏 就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力 如何使其脱敏呢 选育结构类似物抗性突变株 Xr S L 半胱氨酸抗性突变株AECr 效果最佳 应用最广 甲基赖氨酸抗性突变株MLrL 赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株LysHxr苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株ThrHxr L Lys CH2 NH2 CH2 CH2 CH2 CH NH2 COOHAEC CH2 NH2 CH2 S CH2 CH NH2 COOH结构类似物AEC物的作用机制 起反馈抑制作用AEC与L Lys结构相似 被天冬氨酸激酶所误认 与Thr一起在天冬氨酸激酶的变构部位上结合 协同抑制酶活 抗结构类似物突变株的实质 天冬氨酸激酶编码的结构基因发生突变 1 筛选营养缺陷型突变株 2 筛选抗性突变突变株磷酸盐 碳源调控菌株 氨基酸结构类似物抗性突变株二级金属离子抗性突变菌株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身代谢产物抗性突变株抗噬菌体 温度敏感等 次级代谢产物高产菌株的筛选 1 筛选营养缺陷型突变菌株 分支合成途径 氯霉素合成途径氯霉素由莽草酸途径合成 同时还有芳香族氨基酸 会产生反馈抑制 通过诱变筛选 阻断莽草酸到芳香族氨基酸的途径 可增加氯霉素的产量 氯霉素 2 筛选去磷酸盐调节突变株许多抗生素等次级代谢产物的生物合成明显受到磷酸盐的调控 当培养基中磷酸盐的含量超过一定限度 这种代谢产物的合成就受到明显的抑制作用 通过固体琼脂块发酵 加入过量磷酸盐 观察抑菌圈的大小 3 筛选去除碳源分解代谢调节突变株许多能被菌株快速利用的碳源往往对许多次级代谢产物的合成产生阻遏或抑制作用 青霉素发酵中的葡萄糖效应不但抑制抗生素的生物合成 而且抑制某些碳氮源的分解利用 由于葡萄糖对菌体内的分解氮源的酶产生抑制作用 使菌体不能分解利用唯一的氮源组氨酸 菌体不能生长 诱变菌株 涂布到组氨酸和葡萄糖的培养基上原因 葡萄糖分解代谢的酶发生了变化 不再产生和积累分解代谢阻遏物 例2筛选葡萄糖结构类似物抗性突变菌株利用葡萄糖结构类似物2 脱氧葡萄糖 不能被菌体利用 但具有葡萄糖的碳源分解产物阻遏作用 在用乳糖和2 脱氧葡萄糖为碳源 阻遏乳糖利用 筛选少量生长菌落 4 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株许多次级代谢物都是以初级代谢产物如氨基酸等做为前体生物合成这些次级代谢产物 当这种氨基酸前体成为次级代谢产物生物合成的限制因素的时候 筛选这种氨基酸结构类似物抗性突变株 解除这种氨基酸的反馈调节 可提高氨基酸的胞内量 进而提高代谢产物的合成 例1 青霉素合成途径中 半胱氨酸和缬氨酸是生物合成青霉素母核的前体 筛选抗半胱氨酸结构类似物或抗酰胺酸结构类似物的抗性突变株 可提高半胱氨酸或缬氨酸的生成量 进而提高青霉素产量 5 筛选二价金属离子抗性突变株过量的二价金属离子对菌体有毒害 有些次级代谢产物可以与二价金属离子形成盐 降低金属离子的毒害作用 代谢产物越多 解毒作用越强 诱变后涂布到高浓度二价离子培养基上 能长出来的可能是高产菌株 细胞膜通透性菌株剔除 进一步摇瓶筛选 杆菌肽和青霉素 杆菌肽可以与二价离子结合将过量的金属离子带出体外 在培养基中加入大量的硫酸亚铁 硫酸锌 6 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株前体是能够直接被菌体合成代谢产物而自身的分子结构没有显著改变的物质 前体在提高产量的同时也会对菌体产生毒性 筛选前体或前体结构类似物的抗性突变株可以消除前体对产生菌的毒性作用 提高代谢产物的产量 例如 灰黄霉素发酵使用氯化物为前体 但是高浓度氯化物有抑制作用 筛选抗氯化物的突变株 可提高灰黄霉素的产量 例2 苯氧乙酸为青霉素V的前体 筛选抗苯氧乙酸的突变株 例3 缬氨酸是青霉素的前体 筛选抗缬氨酸结构类似物的抗性突变株 提高青霉素的产量青霉素V青霉素G 7 筛选自身代谢产物抗性突变株抗生素生产能力不同的菌株 对自身所产生抗生素的耐受能力也不同 一般来说高产菌株需要耐受高的自身代谢产物才能够生存 而低产菌株不需要耐受高的自身代谢产物就能够生存 例如把金霉素产生菌多次移种到金霉素不断提高的培养基中 最后得到一株提高生存能力4倍的突变株 青霉素 链霉素 庆大霉素等抗生素的产生菌均有用此方法提高产量的例子 原生质体的融合 一 PEG融合的机制 膜电位降低 脱水作用 二 原生质体融合的一般过程1 遗传标记的选择 营养缺陷型和抗药性标记 2 两亲本原生质体的制备3 原生质体的融合 融合剂 PEG 钙镁离子 4 原生质体的再生5 融合子的选择 利用亲本的选择性标记 产生杂合二倍体或单倍体重组体 另一种是暂时的融合 异核体 基因工程技术育种的设计 技术 提高限速酶的活力 解除抗