三七不同部位及总皂苷提取物的HPLC指纹图谱研究.doc

三七不同部位及总皂苷提取物的HPLC指纹图谱研究崔翰明，张秋燕，彭 亮，路文龙，王 阶*中国中医科学院广安门医院（北京市宣武区北线阁5号，100053）摘要：目的 建立三七不同部位及总皂苷提取物的HPLC指纹图谱分析方法。方法 三七不同药用部位（主根、筋条、剪口、叶、花）和不同规格（20-100头）及总皂苷提取物采用甲醇提取，RP-HPLC/UV法测定，Kromasil C18（250mm4.6mm，5m）色谱柱；乙腈和水（v/v）线性梯度洗脱；流速：1mLmin-1；柱温：30；检测波长：203nm；进样量：20L。结果 三七在80min的色谱图中共确定17个特征峰，主要峰分离良好，经对照品和HPLC/MS判定峰4为三七皂苷R1、峰5为人参皂苷Rg1和Re、峰6为Rf、峰7为Rb1、峰8为Rc、峰9为Rb2、峰10为Rb3、峰11为Rd。以峰4为参照峰（S），计算17个特征峰的相对保留时间和相对峰面积比，各峰精密度、稳定性和测定重现性RSD均小于6.47。通过相似度软件评价，不同规格三七根（20-100头）和剪口、筋条的指纹图谱近似，相似度大于0.971，但三七根和根茎与花和叶差异很大，相似度分别为0.596和0.564。三七总皂苷提取物因药用部位及生产工艺不同，其主要特征峰的峰面积及比例存在较大差异。结论 本方法简便、准确，重现性良好，可用于准确分辨三七不同药用部位及其总皂苷提取物的质量。关键词：三七；高效液相色谱；指纹图谱；三七总皂苷Study on the fingerprint of different part of Panax Notoginseng and total saponins by HPLCCUI Han-ming, ZHANG Qiu-yan, PENG Liang, LU Wen-long, Wang Jie *Guanganmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Science; Beijing 100053,ChinaAbstract: Objective: To establish an analysis method of HPLC fingerprint of the different part of Panax Notoginseng and its total saponins. Method: The different part (including root, rhizome, branch root, leaf, flower) and different specifications of (20-100 pieces per 500g) Panax Notoginseng and its total saponins were extracted with methanol. The HPLC conditions were as following: Kromasil C18 column (2504.6mm，5m), acetonitrile and water linearity gradient elution, flow rate at 1.0mLmin-1, column temperature at 30, wavelength 203nm, injection 20L. Result: The primary peaks in 80min HPLC chromatogram of the different part of Panax Notoginseng were well separated. The 4th，5th，6th，7th，8th，9th，10th，11th peak were identified as Notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1 and Re, Rf, Rb1, Rc, Rb2, Rb3, Rd by control sample and HPLC/MS technique, respectively. 17 character peaks were selected as the fingerprint peaks of Panax Notoginseng. The relative retain time and relative area of 17 peaks were calculated by taking Notoginsenoside R1 peak(4th) as the referential peak. The RSDs of precise and stability and repeatability were less than 6.47%. The similarities of fingerprints were evaluated by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM. The similarities of the roots (20-100 pieces per 500g) and rhizome and branch root of Panax Notoginseng were greater than 0.971, but the similarities of the root and flower and leaf of Panax Notoginseng were 0.596 and 0.564, respectively. For total saponins of Panax Notoginseng were extracted from different parts and productions，the area and ratio of its character peaks were quite different. Conclusion： The method is simple, accurate and repeat, and can be applied in the quality control of the different part and total saponins of Panax Notoginseng.Key words: Panax Notoginseng；HPLC；Fingerprint；Total saponins；国家自然科学基金重大项目（90209011），国家重大新药创制专项（2009ZX09103-355）资助通讯作者：王阶，电话E-mail：作者简介：崔翰明，1972.10，药学硕士，主要从事中药新剂型和质量标准研究，电话010-88001470；E-mail：三七为五加科Araliaceae人参属Panax植物三七Panax notoginsng (Burk) F.H.Chen。始载于本草纲目，主产于我国云南、广西等省，功能散瘀止血、消肿定痛，为临床常用中药。三七的主要有效成分为三七总皂苷，具有扩张血管，降低心肌耗氧量，抑制血小板凝集，延长凝血时间，降血脂，清除自由基，抗炎，抗氧化等药理作用，其中含量较高并有市售标准品的有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rd、Rc和Rf等1，2。目前，商品三七的规格品种多样，质量不一。05版药典规定三七为其原植物的根和根茎，其中主根为临床所用三七，支根习称筋条，根茎习称剪口。三七总皂苷提取物生产厂家常用三七剪口或筋条为原料，民间也有使用三七叶和花。而不同的三七药用部位及其提取物的主要皂苷类成分的含量差别明显3。因此，建立一种三七不同药用部位及其提取物中主要成分的HPLC指纹图谱分析方法，比较不同药用部位和不同规格三七及其提取物的差异具有重要意义。本文采用RP-HPLC/UV法建立三七及其总皂苷提取物的HPLC指纹图谱分析方法，并对不同药用部位和不同规格三七及其总皂苷提取物进行指纹图谱分析，比较其差异。1. 仪器与试药安捷伦1200型HPLC，DAD检测器；三七主根（20-100头）、筋条（支根）、剪口（根茎）、叶、花均购自云南文山；三七对照药材（120941-200506）、三七皂苷R1(110745-200415)、人参皂苷Rg1(110703-200424)、Re(110754-200421)、Rb1(110704-200420)、 Rb2（111715-200802）、Rb3（111686-200501）和Rf（111719-200502）对照品均购自中国药品生物制品检定所；三七总皂苷提取物购自不同厂家或由本实验室制备；甲醇（AR）、乙腈（Fisher公司），高纯水（Millipore超纯水机）。2. 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：Kromasil C18色谱柱（2504.6mm，5m，100）；流动相：乙腈（A）水（B）线性梯度洗脱（v/v），比例见表1；流速：1mLmin-1；柱温：30；检测波长：203nm。进样量：20L。表1：乙腈（A）水（B）流动相梯度表（v/v）时间05min520min2045min4550min5060min6070min乙腈（%）52020363680801001001005水（%）95808064642020000952.2 对照品和供试品溶液的制备分别精密称取适量三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rb3和Rf对照品，加甲醇溶解，制成浓度约为50gmL-1的混合对照品溶液。精密称取药材粗粉2g，置于250mL锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称重，超声（250w）提取45min，冷却至室温，用甲醇补充损失的溶剂，提取液用微孔滤膜（0.45m）滤过，即得供试品溶液（生药浓度40mg/mL）。分别取上述对照品和供试品溶液，按照2.1色谱条件测定，进样20L，记录HPLC色谱图，其结果见图1。精密吸取三七对照药材供试品溶液，按2.1色谱条件，参照文献4的质谱条件测定HPLC/MS总离子流（TIC），结果见图2。图1. 三七对照药材的HPLC/UV指纹图谱由图1可见，上述条件所得三七HPLC图谱具有出峰多，主要特征峰分离度好，样品制备方法简单，结果重现等特点。图2. 三七对照药材的HPLC/MS总离子流图（负离子模式）采用标准品对照和HPLC/MS提取离子流图对主要色谱峰进行鉴别，可共判定出峰4为三七皂苷R1、峰5为人参皂苷Rg1和Re、峰6为人参皂苷Rf、峰7为人参皂苷Rb1、峰8为人参皂苷Rc、峰9为人参皂苷Rb2、峰10为人参皂苷Rb3、峰11为人参皂苷Rd。2.3 参照峰和特征峰的选择分别取三七主根（20、40、60、80和100头规格）、筋条（支根）、剪口（根茎）、叶和花按2.2供试品溶液制备方法制备，按2.1色谱条件测定。根据色谱图，共确定三七中的主要皂苷类成分和其他峰面积较大的（占总峰面积1%以上），且分离良好的特征峰共17个，选取三七特有的三七皂苷R1为参照峰（峰4），以其保留时间和色谱峰面积为1，计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积，进行方法学考察。2.4 方法学考察2.4.1 精密度实验精密吸取三七供试品溶液，按2.1色谱条件测定，分别连续进样5次，以三七皂苷R1为参照峰（S峰）分析所得图谱中特征峰的相对保留时间和峰面积比，并计算RSD。其中S峰保留时间的RSD为0.14%，峰面积的RSD为0.46，其他特征峰的相对保留时间RSD在0.013%0.21%，相对峰面积RSD在0.29%3.44%。2.4.2 稳定性实验精密吸取三七供试品溶液，分别放置1、2、3、5、7天后，按2.1色谱条件测定指纹图谱，以三七皂苷R1为参照峰（S峰）分析所得图谱中特征峰的相对保留时间和峰面积比，并计算RSD。其中S峰保留时间的RSD为0.14%，峰面积的RSD为0.78，其他特征峰的相对保留时间RSD在0.038%0.20%，相对峰面积RSD在0.47%4.24%。2.4.3 重现性实验精密称取同一批三七筋条（支根）9份，按照2.2供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别按2.1色谱条件测定，以三七皂苷R1为参照峰（S峰）分析所得图谱中特征峰的相对保留时间和峰面积比，并计算RSD。其中S峰保留时间的RSD为0.28%，峰面积的RSD为2.24，其他特征峰的相对保留时间RSD在0.023%1.29%，相对峰面积RSD在3.48%6.47%。方法学考察表明本方法精密度、稳定性和重现性良好，可满足三七HPLC指纹图谱测定要求。2.5 三七不同药用部位和不同规格三七主根的HPLC指纹图谱分别精密称取20、40、60、80、100头三七主根、筋条（支根）、剪口（根茎）、叶和花的粗粉2g，按2.2供试品溶液制备方法制备，按2.1色谱条件测定，结果见图3和4。以三七皂苷R1为参照峰（S峰）分析所得图谱中特征峰的相对保留时间和峰面积比，结果见表2和表3。图3. 不同规格三七主根的HPLC指纹图谱（S1-S5分别为20、40、60、80、100头三七）图4. 三七不同药用部位的HPLC指纹图谱（S1-S5分别是三七筋条、剪口、20头、叶、花）表2. 不同规格和不同药用部位的三七的HPLC指纹图谱中主要峰的相对保留时间峰号化学成分20头40头60头80头100头剪口筋条花叶1未知0.2570.2570.2570.2570.2570.2570.2570.2580.2572未知0.4040.4050.4050.4050.4050.4050.4060.407-3未知-0.6580.6594三七皂苷R114.36414.35614.35114.35214.34214.34714.34014.33814.3395人参皂苷Re和Rg11.0801.0791.0801.0791.0791.0791.0801.0781.0786人参皂苷Rf-1.565-1.573-7人参皂苷Rb11.6031.6021.6031.6001.6021.6041.6001.6001.5948人参皂苷Rc1.6531.6541.6551.6541.6551.6541.6551.6491.6529人参皂苷Rb21.7191.7191.7201.7201.7201.7201.7211.7231.72110人参皂苷Rb31.7511.7521.7521.7511.7521.7521.752-11人参皂苷Rd1.8211.8211.8231.8211.8221.8231.8221.8201.82012未知1.8891.8901.890-1.8911.891-13未知3.2133.2143.2163.2153.2163.2153.2173.210- 14未知3.5673.5973.5983.5973.5993.5983.6003.5803.63315未知3.7693.7723.7733.7723.7753.7743.7763.7763.77516未知-3.920-3.922-17未知4.4274.4314.4324.4304.4334.4334.4364.4374.434表3. 不同规格和不同药用部位的三七的HPLC指纹图谱中主要峰的相对峰面积比峰号化学成分20头40头60头80头100头剪口筋条花叶1未知0.3110.3310.3000.1920.6900.1460.1617.6202.4682未知0.1630.1430.1440.0940.1670.1040.1035.988-3未知-17.7574.2064三七皂苷R1峰面积2278.72367.82247.43584.51960.34830.82735.2207.6289.65人参皂苷Re和Rg16.1365.9426.2633.2495.7773.3674.0882.5582.6466人参皂苷Rf-0.106-7.551-7人参皂苷Rb14.4973.2974.7411.5474.3362.1952.1796.0724.1358人参皂苷Rc0.4200.4730.6970.2860.5050.3270.4499.5165.1039人参皂苷Rb20.2310.2990.3390.1270.2660.3090.21114.5005.87410人参皂苷Rb30.2400.2840.4290.1070.2920.1490.333-11人参皂苷Rd1.4791.0621.7490.5161.0590.7650.7882.8902.75712未知0.2530.2600.264-0.1170.158-13未知0.3550.4850.4910.3540.4230.5650.9337.204-14未知0.5060.6190.6250.7260.6260.6980.94452.1132.8115未知1.3450.7780.7530.4500.7740.5090.64425.38114.78216未知-0.162-4.636-17未知0.5190.5260.5220.3210.5620.2380.4096.4714.947从表2和3可知，1、4、5、7、8、9、11、14、15和17号峰为所有三七样品的共有峰；1、2、4、5、7、8、9、10、11、13、14、15和17为地下部分的共有峰；3号峰为叶和花的特征峰。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版，国家药典委员会）分析，不同规格三七（20-100头）和三七地下部分（主根、剪口和筋条）的指纹图谱近似，相似度大于0.971，但与三七花和叶差异很大，相似度分别为0.596和0.564。2.6 三七总皂苷的HPLC指纹图谱采用乙醇回流提取，大孔吸附树脂纯化工艺制备三七总皂苷（主根、筋条和剪口）。分别精密称取不同来源的三七总皂苷，加甲醇超声溶解，配制成2mg/mL的溶液。按照2.1色谱条件测定，分别进样20L，记录色谱图。其结果见图4。图4. 三七总皂苷HPLC指纹图谱（S1-S7分别是三七根、筋条和剪口自提、宁波中药厂、昆明圣火、云南红云、西安国圣）不同来源的三七总皂苷提取物因药用部位（主根、剪口和筋条）及生产厂家（宁波中药厂、昆明圣火、云南红云和西安国圣）不同，其主要特征峰（皂苷类）的峰面积及比例存在较大差异，其中自产提取物（主根、筋条和剪口）和昆明圣火总皂苷相似度较高，相似度分别为0.958、0.954、0.870和0.872；其他厂家差别较大，相似度分别为0.653、0.605、0.628；但所有提取物均有4、5、7、8、9和11号皂苷类成分特征峰。3. 讨论良好的HPLC分析方法是指纹图谱研究的前提，实验中我们采用网格搜索的方法系统研究了流动相组成和梯度洗脱条件，发现乙腈的基线优于甲醇，水优于酸水（磷酸、甲酸和乙酸），以表1的乙腈-水梯度洗脱系统可有效分离三七主要皂苷类成分。根据DAD光谱图比较了文献5-7中的200、203、210nm 3个波长下的色谱图, 发现203nm处的峰信号强度大且出峰多，主要特征峰干扰小、分离度和精密度好。实验中分别采用甲醇超声或回流提取，不同浓度乙醇（60、70、80、95）超声或回流提取，甲醇或乙醇提取液C18固相萃取等方法制备供试液。其中甲醇超声方法所得供试液图谱出峰多，重现性好，主要峰特征性强，多数峰分离度好，样品制备方法简单、准确。上述三七HPLC指纹图谱测定方法经过方法学考察，各特征峰的相对峰面积和相对保留时间的精密度和稳定性RSD均小于4.24%（n=5）；9次实验的相对峰面积测试重现性RSD小于6.47%，表明本方法精密度、稳定性和重现性良好，完全能满足三七HPLC指纹图谱测定要求。在本实验条件下，质谱的负离子检测模式对三七供试品有较好的信号响应，我们根据化合物的质荷比，采用提取离子流图(EIC)对图中的各主要皂苷类色谱峰进行了分子量归属，结果见图5。在同一EIC图中各色谱峰的m/z值相同，由下至上各EIC图所对应的m/z依次为1107.585、799.847、945.550和1077.584。其中799.847分别为人参皂苷Rg1和Rf（tR分别为15.5和22.4min），931.525为