不同产地白花蛇舌草的高效液相色谱指纹图谱分析.pdf

第 4 3卷 2 0 09 焦 第 6期 1 2月 河 南 农 业 大 学 学 报 J o u r n a l o f He n a n Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y Vo 1 4 3 NO 6 De c 2 0 0 9 文章编号 1 0 0 0 2 3 4 0 2 0 0 9 0 6 0 5 9 6 0 5 不 同产地 白花蛇舌草 的高效液相色谱指纹 图谱分析 李 贺敏 周 艳 河 南农 业大 学农 学院 河南 郑 州 4 5 0 0 0 2 摘要 采 用高效液相 色谱技 术 建立 了白花蛇舌草指纹 图谱分析方法 不 同产地 白花蛇舌草共有 1 3个共有峰 除 栽培 白花蛇舌草外 与对照 图谱 相比 各地野 生白花蛇舌草相似 度均在 O 9 0以上 说 明高效液相 色谱 色谱 指纹 图谱技术可用来对 白花蛇舌草进行定性及 比较研 究 关键词 白花蛇舌草 指 纹图谱 高效液相 色谱 法 中图 分 类 号 5 6 7 2 文 献 标 志 码 A S t u d y o n fi n g e r p r i n t s o f He o t i s d if f u s a w i l l d f r o m d i ff e r e n t s o ur c e s b y h i g h p e r f o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y LI He mi n ZHOU Ya n C o l l e g e o f A g r o n o m y H e n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y Z h e n g z h o u 4 5 0 0 0 2 C h i n a Ab s t r a c t T o e s t a b l i s h t h e H P L C fi n g e r p r i n t s o f H e d y o t i s d if f u s a w i l l d c h r o ma t o g r a p h i c e x p e r i m e n t s we r e pe rfo r me d o n t h e r mo b e t a b a s i c C 1 8 c o l u mn e l u t e d wi t h a c e t o n i t r i l e a n d wa t e r c o n t a i ni n g 0 5 a c e t i c a c i d a s t h e mo b i l e p ha s e s i n g r a di e n t e l u t i o n a t t h e flo w r a t e o f 1 0 mL mi n Th e d e t e c t i o n w a v e l e n g t h w a s 3 6 0 n m 1 3 c o m mo n p e a k s w e r e fo u n d i n t h e fi n g e rpr i n t s o f 1 2 b a t c h e s H e d y o t i s d if f u s a wi l l d a n d e x c e p t p l a n t i n g h e r b s g o o d s i mi l a r i t i e s wi t h c o r r e l a t i o n c o e ffic i e n t s h i g h e r t h a n 0 9 we r e f o u n d i n fin g e rp r i n t s b e t we e n t h e h e r b s f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s T h e me t h o d o l o g i c a l e v a l ua t i o n s ho we d t h a t t h e r e s u l t s we r e i n a c c o r d a n c e wi t h t h e t e c hn o l o g i c a l r e q ui r e me n t s o f c h r o ma t o g r a ph y fin g e rp r i n t wh i c h h a s l a i d a g o o d f o u n da t i o n f o r q u a l i t y c o n t r o l o f c o d e x f r a x i ni Ke y w o r d s H e d y o t d if f u s a w i l l d f r i n g e r p r i n t h i g h p e rf o r ma n c e l i q u i d c h r o ma t o g r a p h y 白花 蛇舌 草 始 载 于 广 西 中药 志 中 国药 典 1 9 9 5年 版 一 部 附 录 规 定 其 来 源 为 茜 草 科 R u b i a c e a e 耳 草 属 H e d y o t i s 植 物 白 花 蛇 舌 草 H e d y o t i s d if f u s a w i l l d 的干 燥 全 草 白 花 蛇 舌 草 为近代新开发的常用 中药 具清热解毒 利湿消肿 等功效 含有 黄酮类 蒽醌类 萜类 甾醇 类 有 机酸 类 多糖类等多种化学成分 白花蛇舌草广布于 广东 福建 广西 江苏及安徽等多个省份 野生 白 花蛇舌草种源复杂 由于生境 采收期等诸 多因素 的影 响 质量 参差不 齐 中药历 来强 调产 地 根 据物 种生物学和生态学原理 生长于不同生态环境中的 同种植物 尤其 是广 布性 种类 在 长期 的趋 异 适 应 中 往往形成在体内生理生化特性与形态特征上具 有一定差异 的不同的个体群 即生态型和居群 这 种现象 体现 在 中药 材 方 面 即表 现 为 同基 原 不 同 产地 药材 质 量 的 不 均 活性 单 体 成 分 含 量 的 参差 不齐或组分组成的变异 近年来栽培技术对 白花 蛇舌 草质量 的影 响也有 较多 的研 究 在栽 培 条件下 居群 形成 一 个 生 态 小 环境 又 由于 各 种 栽培措施的影响 栽培白花蛇舌草与野生的相比 其 质量也 会存在 差异 白花 蛇舌 草有 效成分 呈复 杂 化 多样化特性 仅几个指标成分 的测定不能全面 收稿日期 2 0 0 9 0 5 2 8 基金项目 河南省科技攻关项 目 0 5 2 4 4 2 0 0 2 2 作者简介 李贺敏 1 9 7 2一 女 河南上蔡人 讲师 博士 主要从事药用植物栽培学研究 第 6期 李贺敏等 不 同产地 白花蛇 舌草的高效液相色谱指纹 图谱分 析 5 9 7 反应其 内在 质量 本 试 验 采 用 高效 液 相 色 谱 技 术 以梯 度洗脱 方法 对 白花 蛇 舌 草 指 纹 图谱 进 行 了研 究 以期为全面鉴测 白花蛇舌草质量提供依据 1 材料与方法 1 1 仪 器 S h i m a d z u L C一 1 0 A 高 效 液 相 色 谱 仪 L C 一 1 0 A t v p溶 剂 输 送 泵 7 2 2 5 i手 动 进 样 器 S P D 一 1 0 A v p 1 0 A v v p紫外 一可 见检测 器 C T O一1 0 A v p柱 温箱 C l a s s v p色 谱 工 作 站 色谱 柱 T h e r m o B e t a B a s i c一1 8 2 5 0 mm 4 6 mi D 5 m KQ一2 5 0 E 型 医用 超 生 波 清 洗 器 昆 山市 超 生 仪 器 有 限 公 司 上海亚器纯水器 乙腈 色谱纯 美 国S i g m a公 司 甲醇 色谱纯 默克公司 醋酸 分析纯 上海 化学试剂总厂 水 超纯水 自制 并 经 0 4 5 m 水 系滤膜 滤过 1 2材料 不 同产地 样 品 于 2 0 0 7 0 9在 各 地 采 集 各 样 品随机取 样长 势 一 致 的带 根 全植 株 2 0株 由河 南 农 业大 学朱 长 山教 授 鉴 定 为茜 草 科 耳 草 属 白花 蛇 舌草 将 上 述 药 材 样 品 经 低 温 干燥 后 粉 碎 成 粗 粉 过 6 0目筛 备用 药 材具 体种 源见 表 1 表 1 白花蛇 舌草样品编号及采集地点 Ta bl e 1 The numbe r a nd t he l oc at i on o f t h e ma t e r i a l s o f He d y D s d if f u s a wi l l d 1 3 方 法 1 3 1 色谱 条件T h e r m o B e t a B a s i c 一1 8 2 5 0 m m 4 6 m m 5 m 色 谱 柱 柱 温 3 0 o C 以 乙 腈 一 0 5 醋 酸 为流动 相 连续梯 度 洗 脱 体 积 流量 1 0 mL m i n 检 测波长 为 3 6 0 n m 进样 量 l 0 L 1 3 2 供试品溶液制备精密称取 白花蛇舌草样 品 1 0 g 置 1 2 5 m L 圆底 烧 瓶 中 加 人 体 积 分 数 8 0 甲醇 2 0 mL 超 声 提 取 4 0 m i n 取 上 清 液 用 微 孔滤 膜 0 4 5 m 过 滤 取 过 滤 液 作 为 供 试 品 溶液 1 3 3 H P L C分析取 样 品溶 液 1 O L 注 入高 效 液相色谱仪 记录色谱图 图 1 和各色谱峰保留时 间 以 面 积 归 一 化 法 计 算 各 色 谱 峰 相 对 峰 面 积 A 1 4方法 学考 察 1 4 1 精 密度 试 验按样 品制 备 方 法 随机 抽 取 同一产 地 白花 蛇舌 草药 材制 备 供 试 液 连 续进 样 5 次 测定 HP L C色谱图 结果表明 各共有峰相对保 留值 的 R S D 相 对标 准偏 差 为 0 1 9 2 0 7 各共 有峰 相对 峰 面 积 的 R S D 为 0 1 6 2 1 5 表明仪器精密度 良好 1 4 2重现性 试验随机取 同一 产地 白花蛇 舌 草 药材 按样品制备方法平行操作 制备 5份 白花蛇 舌 草药材 供 试 品 溶 液 测 定 其 H P L C色谱 图 结 果 各共 有 峰相 对保 留值 的 R S D 1 各 共 有 峰 相 对 峰 面积 的 R S D为 2 1 6 3 3 6 1 4 3稳 定性试 验取 同一产 地 白花 蛇舌 草药 材 的供 试 品 溶 液 分 别 在 0 4 8 1 2 1 6 h检 测 其 相 对保留值 的 R S D小于 3 主要共有 峰面积 R S D 不 超 过 5 说 明供 试 品溶 液至少 在 1 6 h内是稳 定 的 2结果与分析 2 1指纹 图谱 参照 峰 的选择 通过色谱图比较 图 1 可知各样品色谱图中 3 4 8 9号峰为强信号峰 选取色谱 图中的 8号峰 为参 照峰 计算 各 峰 的相对保 留值 d 2 2相对 保 留值 仅 的窗 口设定 计算各样 品色谱 图中 同一 峰位 值 的 O t 平均 值 作为每个色谱峰的标准 值 计算每个峰位 仅 值的 R S D值 所有 仅值的 R S D均小于 1 同一窗 口内的色谱峰认定 为同一 值 的色谱峰 予以归 并 可信 限范 围在 1 按 国家 食 品药 品监督 管理 局 中药 注 射 剂 指 纹 图谱 研 究 的技 术 要 求 研 究 测定了不同产 地 1 2批 白花蛇舌 草药材 的色谱 图 谱 并制定了 以内参 比峰为参照 物的标准指纹 图 谱 见图 1 1 2批药材指纹图谱的相似性见图 2 2 3共有峰 的标 定 记录 5 0 m i n的色谱 图 通过 比较各峰 的保 留 时间 选择每一个 图谱都产生 的共有峰 采用相对 保 留值 标定 共 有 指纹 峰 以 图谱 中保 留时间 为 5 9 8 河南农业大学学报 第 4 3卷 2 9 0 2 4 ra i n 8号 峰 的峰为 参照物 S 将 各 指纹 峰保 留时 间与 同一 图谱 中参 照物 的保 留时 间 比较 其 比值为各 指纹峰 的相 对保 留值 计 算 l 2批 药材指纹图谱中各指纹峰的相对保 留值 表 2 标 定 白花蛇 舌草药 材 的共 有 峰 为 1 3个 1 2批 样 品药 材 中各 共有峰 的 值 的 R S D均 1 0 1 o 2 0 f mi n 3 0 4 0 5 O 图 1 白花蛇舌草药材标准色谱指纹图谱 F i g 1 F i n g e r p r i n t p e a k o f He d y o t i s d if f u s a w U l d 0 t mi n 图 2 l 2批白花蛇舌草药材色谱图 Fi g 2 Fi n ge r pr i nt pe a k o f 1 2 ba t c he s o f He d y o t i s d if f u s a wi i l d 2 4共有峰 的 相对 面积 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 规 定 以内标物作 为参照物 的指 纹图谱 则 以共有 指纹 峰 中其 中一峰 要求峰 面积相 对较大 较稳定 的共有 峰 的峰面积作为 1 计算其它各共有指纹峰面积的 比值 各共有 指纹峰 的面积 比值必须 相对 固定 中药 材的供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱 各共 有峰面积 的 比值 比较 单 峰面 积 占总峰 面积 2 0 其差 值 2 0 单 峰面 积 占总峰 面积 1 0 而 2 0 其差值 2 5 单 峰 面积 占总峰 面积 1 0 面积 比值不 作要求 仅需检定 相对保 留值 白 花蛇舌草药材各共 有峰 中峰 8 峰 9 单 峰面积 占总峰 面积的百分 比为 1 8 9 和1 9 5 各共 有峰 间差 值 均 2 5 其 它峰 的单 峰 面积 占总 峰 面积 的百分 比 均小于 1 0 设定峰 8为参照峰见表 3 结果符合指 纹 图谱研究 的技 术要求 2 5非 共有 峰面 积 通过对 1 2批 白花 蛇 舌草 药 材 的测 定 统 计 各 批非 共有 峰面 积 比 其非 共 有峰 面积百 分 比在 1 0 8 9 3 7 符 合 指 纹 谱 研 究 规 定 小 于 1 0 的检 测要求 表 4 2 6共 有峰 的相似 度计算 选取 色谱 图 中 的 1 3个共 有 峰 由 中药 色谱 图 分 析和数 据管 理软 件辅 助 自动 进行 峰匹配 以 9号 样 品色谱 图做参 照 指纹 图谱 利用相 关系数 和夹角 余 弦法计 算 指 纹 图谱 的相 似 度 结 果 见 表 5 两 种 计算方法 除 1 7和 8号样 品外 其它样品的相似 度均在 0 9 0以上 这 表 明所建 立 指纹 图谱 的技术 指标稳定 重 现性 好 表 2 白花蛇舌草药材共有峰相对保留值 Ta b l e 2 Re l a t i v e r e t e n t i o n t i me o f mu t u a l p e a k s o f He d y o t i s d if f u s a wi l l d 第 6期 李 贺敏等 不同产地 白花蛇舌草 的高效液相色谱指纹 图谱分析 5 9 9 表5色 谱图 相 似性 分析 结 果 3 J 结 Tab l e 5 Re s ul t s o f c o m pa r a bi l i t y o f c hr oma t o gr a m 本 试 验 比较 了 不 同 提 取 溶 剂 如 9 5 乙 醇 7 0 乙醇 4 5 乙醇 5 0 甲醇 8 0 甲醇 甲醇 的 水 浴 回流 索 氏提 取 超 声 提 取 等 不 同 提取 方 法 的 提取效果 以 8 0 甲醇提取的总体效果为佳 同时 还 考察 了 以 甲 醇 为 提 取 溶 剂 不 同 提 取 时 间 3 O 4 0 6 0 mi n 的提 取效 果 结 果 表 明 以 甲醇 为 提 取 溶 剂 超 声提 取 4 0 mi n 提取 较 完 全 且 方 法 稳 定 重 现性好 采用二级管阵列检测器对指纹图谱 的检测波 长进 行 了 选 择 从 2 1 0 4 0 0 n m 内 先 选 出 2 2 0 2 5 4 2 9 0 3 3 0 3 6 0 a m分离度较 好 的波长 分析 比 较各波长下指纹图谱 发现检测波长为 3 6 0 a m时 色谱 图所 包 含 的信 息 量最 大 且 各 色谱 峰分 离 较 好 河南农业大学学报 第 4 3卷 在流 动相 系统 的选择 中 分 别 以乙腈 一水 乙 腈 一 0 1 醋 酸 乙腈 一0 5醋 酸 乙腈 一水 一冰 醋 酸 甲醇 一 水 甲醇 一 0 1醋酸 甲醇 一 0 5 醋酸 等不 同体 积分数 不 同比例 的流动 系统进 行等 度和 梯度洗脱试验 结果表明 用乙腈 一 0 5 醋酸进行 梯度洗脱为佳 在调整好流动相的不同时间洗脱 比 例之后 各峰的保 留时间适中 且基线较平稳 不易 漂移 有利于指纹 图谱的分析 本试 验 对 白花 蛇舌 草 主产 区 的野生 品和栽 培 品进 行 了指纹 图谱 分析 从 色 谱 图上 比较 各批 样 品色谱图概貌一致 说 明该药 材群体成分一致 制 定的指纹 图谱可对 白花蛇舌草药材的组分群体特 征作出判断 1 7 9号药材为栽培 品 相 似度分析 表 明 这 些样 品的 相 似度 较 低 与 其 它野 生 品的差 异较大 说 明栽 培 品 与 野 生 品存 在 有 明显 质 量 差 异 且主要体现在各种成分的含量上 地域临近的 野生品相似度较接近 如来 自云南屏边 的 1 1和 1 2 号样 品的相似 度均 为 0 9 0 来 自广 东佛 山 5号 和 6 号样 品的相似 度分别 为 0 9 6和 0 9 4 这 与刘 小平 等 的研 究结果 一致 本 研 究首 次 对不 同产地 的栽 培 和野 生 白花 蛇 舌草进行了指纹图谱分析 建立的指纹图谱可用 以 白花 蛇舌草 的真伪 鉴别 并 可对 主产 区白花蛇舌 草 栽培 和野 生品进行 区分 通过 指纹 图谱对 白花 蛇舌 草药 材进行 综合宏 观分析 较 比对其 单一 成分 进行 分析评 判 有 利于 全 面控 制 药 材 质 量 促 进 白花 蛇 舌草 药材及 其制 剂 研 制水 平 和 质量 控 制 的全 面 提 高 并为白花蛇舌草药材质量标准的初步建立提供 一 定 的参考 参 考 文 献 卫生部药典委员会 中国药典 M 第 1部 广 州 广 东 科技 出 版 社 1 9 9 5 51 5 2 肖小河 中 国道地药 材论丛 M 北 京 中 国古 籍 出 版社 1 9 9 7 1 7 0一l 7 3 胡世林 廖福龙 中药材道地性 与生 物多样性 J 中 国医药学报 1 9 9 9 1 4 5 1 6 黄璐琦 张瑞 贤 道地药材的生物学探讨 J 中国药 学杂志 1 9 9 7 3 2 9 5 6 3 5 6 7 李隆云 肖小 河 秦松云 等 道地药材 的形成 与分化 探讨 J 中国中医药科 技 1 9 9 9 6 2 1 0 4 1 0 6 李贺敏 李潮海 种植密度对 白花 蛇舌草生长 和产量 的 影 响 J 中 国 中 药 杂 志 2 0 0 8 3 3 2 0 2 41 0 2 41 3 李贺敏 李潮海 白花蛇舌草 氮 磷 钾 吸收分 配特性 研究 J 中草药 2 0 0 7 3 8 1 0 1 5 6 1 1 5 6 9 李贺敏 李潮 海 等 施 肥对 白花蛇舌 草产 量和 品质 的影 响 J 河 南 农 业 大 学 学 报 2 0 0 8 4 2 1 1 8 21 刘小平 高 申蓉 白花蛇舌草 的 H P L C指纹 图谱研究 J 中药材 2 0 0 5 2 8 2 9 1 9 4 责任 编辑 常恩敏 上接第 5 9 5页 8 章启 发 陈刚 刘光亮 等 施肥 技术对上部 烟叶使 用价值的影响 J 中国烟草科学 1 9