指纹图谱研究.docx

指纹图谱在白酒中的应用研究进展袁 洁，尹京苑，高海燕*(上海大学生命科学学院，上海 200444)摘 要：指纹图谱技术是分析天然产物和产品的有效手段。本文介绍了指纹图谱的概念、分类方法、白酒指纹图谱构建原理及现代光谱、色谱分析技术在白酒指纹图谱中的应用。提出了白酒指纹图谱建立的要求、目前存在的问题，以及在白酒生产、质量控制中的应用，并对未来白酒指纹图谱的发展方向进行了展望。关键词：白酒；指纹图谱；构建；应用Advances in Application of Fingerprint Technology in Chinese Spirit IndustryYUAN Jie，YIN Jing-yuan，GAO Hai-yan*(College of Life Science, Shanghai University, Shanghai 200444, China)Abstract：The technology of fingerprint is an effective means to analyze the natural products. In this paper, the concept andthe classification of the fingerprint spectrogram were introduced, as well as the construction theory of fingerprint spectrogramand the application of spectral and chromatographic analyses in the fingerprint of Chinese spirit. The requirements of constructingspirit fingerprint spectrogram, the application of fingerprint technology in spirit manufacture and quality control，thepresent problem and future development of spirit fingerprint technology were also discussed.Key words：Chinese spirit；fingerprint；construction；application中图分类号：TS262.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)11-0680-05收稿日期：2008-05-20基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAK04A05-3)作者简介：袁洁(1984-)， 女，硕士研究生，研究方向为白酒感官分析技术研究和标准制定。E-mail：bread_* 通讯作者：高海燕(1975-)，女，副教授，博士，研究方向为食品安全、食品感官分析、农产品深加工。E-mail：专题论述食品科学2008, Vol. 29, No. 11 681富和有用的多，是一种实现对样品多组分，多指标分析的理想方法。1.2 构建指纹图谱常用方法目前构建指纹图谱常用技术有光谱技术和色谱技术，如通过光谱技术得到的指纹图谱有紫外指纹图谱、红外指纹图谱、原子吸收指纹图谱、原子荧光指纹图谱等。色谱技术主要包括气相色谱(联用)技术和高效液相色谱( 联用) 技术。前者主要用于挥发性物质的分析，后者主要用于可溶性物质的检测，得到的指纹图谱分别为气相指纹图谱和高效液相指纹图谱。除此之外，在分子生物学研究领域，对动植物细胞的DNA 和蛋白质分子的研究中，还可通过一系列分子生物学技术获得DNA 指纹图谱、蛋白质指纹图谱。通过图谱研究，能更深入地解释生物体的生命活动6-10。1.3 指纹图谱技术特点指纹图谱具体具有以下几个特点：(1)特征性和专属性，通过指纹图谱能有效鉴别样品的真伪；( 2 ) 可量化性，根据主要特征峰的面积或比例，能有效控制样品质量，确保样品质量的相对稳定；( 3 ) 稳定性、重现性和再现性，这是由图谱采集环境(分析测试手段) 决定的，对于同种样品，只要图谱采集条件一致，那么所得的图谱也一致；( 4 ) 有效性，这应与样品各组分相联系，并且在统计学上其数据有鉴别意义；(5)完整性，由于样品成分未被全部阐明，因此，仅对某些成分进行定性、定量分析，不能有效控制样品质量，所以图谱中应能相对全面、系统地表现样品已知和未知物质成分；(6)模糊性，因为样品成分间的协同交互作用复杂，故可采用模糊数学的分析手段来解决实际问题1-2。2 白酒指纹图谱的构建白酒分析检测技术主要有光谱分析技术和色谱技术。光谱分析技术包括紫外- 可见光谱分析法，近红外光谱分析法，原子吸收光谱分析法等 7 。紫外- 可见光谱分析在酿酒原料的检测方面具有很大的优势，如今已成功应用于对原料的监控。原子吸收光谱分析技术可以说是在白酒分析中应用仅次于气相色谱分析的一类分析技术，采用这类分析技术，可以快速、高效的鉴定出产品中的多种金属离子的含量。近红外光谱技术是近年才引起白酒行业关注的一类分析检测技术。它可以进行定量分析，也可以进行定性分析。由于其具备强大的化学计量学软件，因此可以对大量样品的光谱图进行数学的处理和分析，从而得到许多意想不到的结果。该类技术在新时期引起研究者们的广泛关注7,11。由于白酒的主要成分多为挥发性有机物，目前，研究人员多采用气相色谱(联用)技术对白酒香味成分进行剖析研究，因此，气相色谱(联用)技术是目前构建白酒指纹图谱的主要方法。利用气相色谱(联用)技术构建白酒的指纹图谱，从技术上来讲，至少满足以下四个条件：第一，色谱分析柱能分离出足够多的微量组分。这些组分应该包括白酒中所含有的最主要的几类有机化学成分，即能全面反映白酒所含化学成分的种类与数量。第二，分析的稳定性要好。即重现性应能满足谱图比对的需要，这要求气相色谱仪应具有较好的稳定性和较高的检测灵敏度，同时在规定的方法与条件下，各人误差和实验室之间的误差能满足谱图比对的需要。第三，分析时间不能太长。由于白酒中个组分的分子量大小有很大差异、组分之间的沸点也相差悬殊，因此用同一色谱条件进行分析，肯定需要很长时间，必须使用程序升温才能将分析时间控制在最少。第四，指纹图谱相似度比对技术的应用 6 。随着科学技术的发展和相关实验室条件的完善，上述的四点都可以得到实现，因此，建立白酒的指纹图谱是现实而又可行的。白酒指纹图谱的构建与其他指纹图谱构建步骤类似：首先进行图谱数据采集，需要确定酒样进样方式和进样量以及所用的色谱条件包括色谱柱的选择、载气、温度、流速等。如采用质谱联用技术，还需确定质谱条件；其次，根据得到的白酒气相色谱图，构建白酒指纹图谱库；最后，通过化学计量法，数据挖掘等技术对白酒指纹图谱进行模式识别。2.1 图谱数据采集目前，利用气相色谱（联用）技术剖析白酒的香味成分的方法主要有填充柱直接进样、毛细管柱直接进样和前处理后直接进样分析法，前处理后直接进样分析法包括吹扫捕集法、含氮化合物富集、23 种游离有机酸非衍生化分析技术法。以下对白酒检测中用到的几种分析技术及其各自的优缺点作简单介绍。2.1.1 填充柱直接进样分析该技术是由内蒙古轻工所沈尧坤等于1976 年建立起来直接进样测定白酒中主要的醇、醛、酯等10 多种香味组分的方法，历经30 年，已得到广泛的应用，现已成为白酒质量控制的必备柱型。然而该柱型直接进样分析白酒时，有机酸一般不能从柱中流出色谱峰，如要在此类填充柱上分析与白酒口味密切相关的乳酸和脂肪酸时，则需采用酯化衍生法，操作繁琐，不便于控制白酒中酸性组分的量比关系，且在该柱上分析白酒时，乙酸乙酯峰处于乙醇拖尾峰上，影响其定量重复性。DNP 柱效不高时，内标乙酸丁酯和异戊醇不能得到基线分离，也影响组分的定量结果 9 。2.1.2 毛细管柱直接进样分析中国食品发酵工业研究院自20 世纪80 年代后期分别开发了一系列采用PEG20M、键合FFAP(SGE 商品号为682 2008, Vol. 29, No. 11 食品科学专题论述BP21)、HP-INNOWax 与CPWax57CB 等各种类型毛细管柱直接进样方式定量测定白酒中60 余种醇、醛、酸、酯的方法 12 。但在前三种固定液毛细管柱上，白酒的关键组分(清香型白酒的主体香组分)乙酸乙酯和乙缩醛无法分离，要分析乙酸乙酯含量时，不得不换用DNP 填充柱，这样操作起来费时费力。CP-Wax 57CB 柱在分流比大，进样量少时具有分离乙酸乙酯和乙缩醛的优越性，然而该法中毛细管柱容量小，设备昂贵，定量允许误差、GC 重现性都不如填充柱好，且白酒厂有时需要分析酒醅、酒糟和发酵液及失光成品酒时，如在毛细管柱上直接进样，也会损害毛细管柱，这样使得白酒厂的质量控制分析的许多工作仍在填充柱GC 上完成。2.1.3 适当的前处理后直接进样分析 吹扫捕集法吹扫捕集法(purge and trap，也称动态顶空法) 是国外在上世纪八十年代中期引入啤酒分析的新技术，它对于低至 10-9 级的微量挥发性组分具有高度富集作用和定量重现的特点，使它显示了极为广泛的应用前景，但装置相对较贵，对使用者的技术要求极高 13 。然而由于它的选择吸附恰恰可排除白酒中多量的水和乙醇，而保留其他香味组分，而且它所富集的挥发性组分与人的嗅觉较为接近，因而是十分有效的分析手段。目前，这一方法的主要应用对象为含量在1mg/L 以下，直接进样法的灵敏度无法满足测定的微量挥发性组分9。胡国栋等采用此技术分析白酒的微量挥发性组分，分离并定量了74 种挥发性风味物质，包括41 种酯类物质、10 种醇、12 种酮、10 种缩醛和1 种芳香烃。约40 种挥发性成分是直接进样法无法测得的14。 含氮化合物富集分析以烷基吡嗪为代表的含氮化合物是具有酱香或焦香风味的白酒中十分重要的香味组分，由于含量大多低于1mg/L，因此在分析上颇具难度。国外传统方法在用于白酒分析时仅能测定少数几种组分15-16，其问题的症结在于作组分离时样品的酸化程度不能够保证吡嗪类组分的定量分离。余晓等通过对吡嗪解离常数的测算，改进了提取时的酸化条件17，在该方法中，36 种含氮化合物得到了鉴别和测定，其中29 种为吡嗪类化合物。采用内标法时可供定量测定的组分为21 种。 23 种游离有机酸非衍生化分析白酒中的游离有机酸，特别是脂肪酸是极为重要的香味组分，它们的含量虽不高，但由于其有明显的呈味作用，因而在白酒的香味组分研究中具有重要地位。传统的测定方法繁琐且影响定量的准确性。1990 年代，随着毛细管柱技术的进步，使脂肪酸不经衍生而直接供GC 测定成为可能，目前，C2C8 的游离短链脂肪酸可通过酒样直接进样进行测定，而C9 以上的长链脂肪酸还需采取浓缩步骤，酒样需经中和、减压浓缩至近干，然后以甲酸酸化即可供GC 测定。胡国栋等采用此法鉴别和测定20 种从C2C18 的游离有机酸和三种苯羧酸18。基于这种分析技术，我国研究人员在19891991 年对白云边等浓酱兼香型白酒和景芝白干为代表的芝麻香型白酒的香味组分剖析工作19-20，19921994 年又进行了以四特酒为代表的特香型白酒的香味组分剖析工作，得出特香型白酒富含奇数碳脂肪酸乙酯的特点21，为这些白酒的行标制订奠定了坚实的基础。1997 年，又进行了酱香型白酒呋喃酮和吡喃酮类化合物的分析研究，得出贵州茅台酒等白酒的酱香与酱油的酱香不是同一种特征香味物质的结论22。 白酒中酚类及含硫化合物的测定通常，含硫的有机化合物在饮料酒中的含量极其低微,但由于它们的香味阈值很小，因而对酒的风味具有一定的影响23。挥发性含硫化合物可采用吹扫捕集技术富集后供GC/FPD 测定，白酒中的硫醚，包括二甲基硫、二甲基二硫和二甲基三硫的分析均可用此法进行24。酚类化合物几乎是饮料酒必不可缺的香味组分，其中，挥发性酚类化合物包括了苯酚，烷基取代酚及愈疮木酚系列组分，由于它们具有弱酸性，因而可在溶剂提取后以族分离方式加以分离。至于非挥发酚，则涵盖了酚酸、酚醛等难挥发组分，采用PVPP 作为吸附载体，可从白酒中选择性吸附该类组分。为供GC 和GC/MS 分析，则需将其转化为TMS 衍生物后方可进行，采用此法测定了茅台酒中的11 种非挥发酚21。这2 种测定方法的组合，为全面了解我国白酒的酚类化合物组成提供了有效的手段。2.2 图谱库的建立白酒指纹图谱库主要用来对样品信息，实验条件，所得图谱数据进行归纳分析和整理，主要包括以下几个方面内容：首先，建立白酒样品信息，包括样品生产地，购买来源，以及样品的香型、酒精度、生产批次等基本信息。其次，建立白酒样品制取的方法、检测分析所采用的色谱条件信息，如采用质谱联用技术还应包括质谱条件。最后，根据确定的分析条件得到每种白酒对应的一套指纹图谱，根据所得图谱数据进行统计分析，确定各样品白酒的主要香味化学成分含量和量比关系，如果是不同批次的白酒样品，还要确定其含量和量比关系的范围；对白酒指纹成分含量及量比关系建立数据表格。根据数据表格，研究人员就可以了解不同香型白酒的主要香气成分以及含量上的区别，对于同种类，不同批次的样品，也可通过数据分析来了解它们在香气成分及含量上有无区别。2.3 图谱模式识别在白酒指纹图谱的应用中，依靠指纹图谱评价白酒质量时，必然遇到指纹图谱的判别和识别的问题，所以有必要以化学计量学、数据挖掘技术等方法为基础，建立起白酒指纹图谱计算机模式识别系统，评价指纹图专题论述食品科学2008, Vol. 29, No. 11 683谱的相关性，进而判别白酒的质量。模式识别是根据白酒所含化学成分用数学手段对其进行分类或描述，其中回归分析、聚类分析、判别分析、相关分析、主成分分析等多元统计方法及用于非线性体系的人工神经网络技术等在白酒质量控制中得到很好的应用。较为常用的指纹图谱模式识别算法有如下几种。2.3.1 主成分分析主成分分析是设法将原来变量重新组合成一组新的互相无关的几个综合变量来代替原来变量，同时根据实际需要从中可取几个较少的综合变量尽可能多地反映原来变量的信息。该法具有变差最优性、熵达到极小值、相关最优性、回归最优性等特点。陈华等以46 种白酒为样本，色谱分析所得数据以及感官评价结果为指标用主成分分析法研究了影响白酒香型的主要因素25-26。主成分分析可以解决白酒成分复杂，分析数据量大的问题， 使白酒分析系统、科学、客观。2.3.2 聚类分析聚类分析是采用定量数学方法，根据一批样品的多个观测指标，找出一些能够度量样品或指标之间相似程度的统计量，以这些统计量为划分类型的依据。把一些相似程度较大的样品(或指标)聚合为一类，把另一些彼此相似的样品聚合为另一类，关系密切的聚合到一个小分类单位，关系疏远聚合到一个大分类单位，直到把所有样品(或指标)聚合完毕。目前常用的聚类方法有K- 均值聚类、系统聚类等。采用不同的聚类方法，对于相同的记录集合可能有不同的划分结果；划分结果也会随选择的相似系数或距离的不同而发生变化。白酒种类繁多，新香型不断被发现，对新香型的确定，对各香型的归类，区分，聚类分析方法起着很大作用。陈华用聚类分析研究了白酒香型数据，所得分析结果理想25,27。2.3.3 判别分析判别分析是根据事物特点的变量值和它们所属的类求出判别函数，根据判别函数对未知所属类别的事物进行分类的一种分析方法。判别分析的方法和准则各色各样，如马氏距离判别法、Fisher 判别法、Bayes 判别法、逐步判别法等。通过判别分析，研究者们可以分析一种酒属于那种香型，有助于对新酒的认识，识别，归类，还可以通过判别分析，分析待测样品与标准样品之间的相似度，便于对样品质量的控制。陈华等用贝叶斯判别法对34 个浓香、清香、酱香型样本进行了判别分析，并用12 个待判样本检验了判别方程的有效性25,28。2.3.4 人工神经网络人工神经网络是基于神经科学研究成果基础上发展出来的人工神经网络模型，反映了人脑功能的若干功能的基本特征，是仿照生理神经网络结构的非线性预测模型，具有非线性学习、自组织、自适应、联想记忆的优点，可用于模式识别、数据处理、预测、分析组效关系等 1 0 。神经网络对于处理一些关系不明确、背景不清楚、推理规则不确定的问题具有独到之处。目前，己经发展了几十种神经网络，例如Hopficld 模型，Feldmann 等的连接模型，Hinton 等的玻尔茨曼机模型，以及Rumelhart 等的多层感知机模型和的自组织网络模型等。3 白酒指纹图谱的应用白酒指纹图谱的应用非常广泛，在白酒勾兑调味工艺，真伪白酒识别等方面可以直接通过指纹图谱比对，根据出峰数量、峰形大小对图谱进行定性识别。此外，对于未知白酒的归类、白酒质量控制等方面往往会涉及到指纹图谱的相似度计算，对指纹图谱进行定量识别。3.1 白酒勾兑工艺及真伪识别白酒的勾兑调味工艺是指在生产酿造过程中，通过半成品酒之间的相互混合，得到质量比较稳定，并在主要质量指标上达到成品酒标准的基础酒，然后在基础酒中添加少量特殊工艺酿造的调味酒。这项工艺技术过去一直是由勾兑师凭借敏锐的感官品尝和丰富的勾兑调味经验进行操作 2 9 ，使得技术难以推广，并且存在很大的操作误差。通过白酒指纹图谱分析就可以使这个技术更加科学化、规范化。在白酒的勾兑中，首先，建立基础酒、调味酒以及本厂优质酒的指纹图谱，其次，以优质酒的指纹图谱为目标，按照缺什么补什么的原则选取基础酒及调味酒进行多次组合，将组合后的酒样图谱与目标酒样指纹图谱进行比较，找出差异，再进行组合，再比对，直到两张图谱的差异在研究者所接受的范围内。通过白酒指纹图谱使白酒勾兑技术得到更好的推广和普及13,30。白酒质量的差异性主要是由酒中微量物质表现出来的，对于纯粮酿造的白酒，其指纹图谱中有很多峰未定性，人为无法添加，而低档酒、伪制酒的峰数量却少得多，尤其是高温部分峰存在很大区别，同时峰形也要小得多，所以，对于优质高档白酒，根据图谱基本上可以判别其真伪。3.2 白酒质量控制及未知酒的归类在实际应用中，检测白酒质量是否合格、对未知酒的归类等问题上，会涉及到指纹图谱的相似度计算，指纹图谱的相似度计算一般采用夹角余弦法或相关系数法。由于方法复杂，而且色谱分析数据量大，用EXCEL进行谱峰的匹配和计算也是一项繁杂的工作。指纹图谱相似度计算软件很好地解决了这个问题，它是专用于对各种图谱进行综合峰面积比较的计算软件，其工作原理是利用色谱流出曲线中保留时间对色谱峰进行匹配，然后对匹配峰面积进行比值计算，综合计算出图谱之间的684 2008, Vol. 29, No. 11 食品科学专题论述相似度，从而实现对样品差异程度的评价31-32。相似度计算软件可以对白酒产品批次间稳定性、产品之间的差异性进行评价，具有直观、全面的优点，同时可以避免数据校正计算的误差，因此将它应用于白酒质量控制及未知酒的归类是可行的。在分析时往往选取一个标准样品用作参比，作为相似度计算的基准；或将参与比较的所有样品利用软件进行平均，得出其共有模式，作为基准，其他样品通过与之相对计算，计算出相似度。相似度在0.91.0 之间表示样品间具有较好的相似性，即品质一致性。利用指纹图谱相似度计算软件，也可以实现对分析数据稳定性、重复性的评价。4 结 语白酒指纹图谱的研究是近年来的一个研究热点，指纹图谱技术有望成为白酒质量控制的标准方法，在白酒成分的研究发挥重要作用。然而，要使指纹图谱真正成为国际认可的质量控制标准，尚有些问题需要解决。今后一段时间白酒指纹图谱的研究可能集中在以下几个方面，第一是如何获得良好的白酒指纹图谱。关键之一是选择合适的具有高分离效能的色谱柱，使其基本上可以满足白酒香气组分全分析的要求，同时，毛细管柱的正确安装也对获取良好的色谱分析结果极为重要。在具备了性能优良的气相色谱仪、毛细管色谱柱后，要实现对白酒这种多元混合物的高效快速分离，必须全面了解各种操作条件对色谱峰位、峰宽的影响，从而有针对性地选择合适的毛细管柱、载气及其流速、温度和进样量等实验条件，以求实现快速的有效分离。这些都需要操作人员不断地摸索、积累经验，掌握操作中的关键点，实现准确的定性定量。第二是如何更好地对指纹图谱进行分析。首先需要采用联用技术，如GC-MS、GC-IR 等方法对图谱中反映出来的白酒香味成分，进行有效的分离和结构鉴定。其次，需要对现有的图谱识别方法、相似度计算方法以及图谱的计算机辅助分析方法等不断地进行改进优化，使图谱分析更加规范化、科学化。第三是如何把指纹图谱的信息与白酒的人工感官品评结合起来。白酒作为一种食品，只有同人的感官评价相结合，才能更全面地了解不同种类白酒的香味特征。相信随着研究的深入，指纹图谱技术在白酒行业中的应用将会更加广泛，会在白酒风格特征分析、特色鉴别、质量控制及产品开发等方面发挥巨大的作用，为我国传统白酒的快速发展提供强有力的技术支持。参考文献：1 王睿, 徐伟, 方翼. 中药指纹图谱研究进展J. 中国药师, 2004, 10(7): 764-767.2 石志红, 何建涛, 常文保. 中药指纹图谱技术J. 大学化学, 2004, 19(1): 33-40.3 白长敏，许燕娟.烟草多组分指纹图谱及模式识别研究C/ 大连国际色谱学术报告会和展览会文集. 大连: 中国化学会, 2007.4 曲国福, 陆舍铭, 孟昭宇. 色谱指纹图谱在烟用香精质量控制中的应用J, 烟草科技, 2007(7): 46-505 李蓉, 曹慧君. 烟用香精香料的气相色谱特征指纹图谱分类研究J.化工时刊, 2007, 21(8): 45-486 王超. 指纹图谱质量评价系统D. 成都: 四川大学, 2005.7 汪地强, 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