反转录实验步骤总结.doc

一前期对一些重要试剂用量的评估（以mRNA 100ng为计算标准）1.如果原材料0.2g（约5株2周苗期的苗），分成两管，每管0.1g，则分别加TRIzol 2ml（共4ml），也就是说，每个生物样品作两次生物重复的话。每瓶TRIzol有100ml，所以可以做25个材料。2.一个材料作二次生物重复，需要4根Zymo RNA纯化柱。一个标准Zymo Kit有100个反应柱子，也就是可以做25个材料。3.RNA fragmentation完整Kit可以做100个样品。4.mini/midi Kit可以做12个柱子反应。二前期准备工作1.DEPC处理的Rnase free水；2.RNA专用的75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷和NaOAc；3.220烘烤6小时的研磨棒、器皿和药匙；4.足够的液氮；三其它小知识理论上，每100mg材料可以获得100-200ug total RNA，纯化后获得的mRNA的量约为total RNA量的1/100。四具体实验步骤（一）TRIzol提取总RNA1 先将研磨棒等用液氮预冷，然后加液氮粉碎叶片（组织），越细越好。2 准备好TRIzol管，每50-100mg材料加入1mlTRIzol（材料体积应小于TRIzol体积的10%），振荡或用移液器打至无大颗粒（震荡2分钟可）。3 悬液室温放置5min(可30min放置)。再加入1/5V（起始体积）氯仿，剧烈振荡1-2分钟，室温放置5min。然后13000rpm 2-8 离心30 min。4 吸取无色上清（约有1/2的起始体积量），加入1/2 V（起始体积）异丙醇。室温放置10 min。然后13000rpm 2-8 离心30 min。5 弃上清液。沉淀物以75%乙醇洗涤（1ml乙醇/1mlTRIzol）。然后13000rpm 2-8 离心10min。6 空转一次，吸去上清。7 适当干燥5 min。加入经DEPC处理的Rnase free水100ul，冰浴1小时。8 检测：2l电泳检测，另取1l稀释10倍后测OD值。9 【用RNase free 的Dnase酶切。（一般100ug 的总RNA中加4%-5%V的RNase inhibitor和10-20U的 Dnase，然后37 30 min）。】10 如果暂时不用，可以加1/10V的3M PH5.5的NaOAc和3V体积无水乙醇，-80放置2小时以上或overnight。然后12500rpm 2-8 离心15 min，重复step 5-7。（二）从总RNA提取mRNA（Oligotex mRNA Midi Kit）（REPEAT）(NOTE:Oligotex、OBB先37预热，然后振荡，25备用。OEB 70预热。)1 根据以下表格依次混合在1.5ml微离心管内。须充分混合。total RNAadd Rnase-free water to total RNA sample:Buffer OBB(l)Oligotex Suspension(l)=0.25mg250l25015 (mini Kit)0.25-0.50mg500l50030 (midi Kit)0.50-0.75mg500l50045 (midi Kit)0.75-1.00mg500l50055 (midi Kit)2 在70水浴3 min。再室温放置20 min。然后以14000-18000 rpm 离心2 min，直至上清液澄清。（可将所弃上清液另外保留，第一遍提取结束后回收原先的Oligotex再次加10l 新的Oligotex，第二遍提取mRNA。）3 沉淀用等体积的OBB和Rnase-free Water充分振荡混合，再70水浴3 min。再室温放置20 min。然后以14000-18000 rpm 离心2 min，直至上清液澄清。4 用400l的Buffer OW2 充分振荡混合，转移至小离心柱放置于1.5ml微离心管内，以14000-18000 rpm 离心1 min；重复此步骤。5 再以14000-18000 rpm 空转离心1 min。6 将此小离心柱换入新的Rnase-free的1.5ml微离心管内。把70预热的Buffer OEB 75l加入离心柱中，用移液器吹打3-4下后，即以14000-18000 rpm 离心1 min进行洗脱。为了保证能彻底的洗脱下来，重复此步骤，最后为150l。（NOTE:多样品时，为保证洗脱效率，可将内置小离心柱的微离心管先置于70预热。）7 适量电泳检测。另取适量测OD值。（三）纯化mRNA（每柱量10000 rpm 离心1 min。2. 然后加350l Wash Buffer至离心柱，以10000 rpm 离心1 min。重复此步骤。3. 再以 10000rpm 空转离心1 min。4. 将此小离心柱换入新的Rnase-free的1.5ml微离心管内。用43l Rnase-free Water洗脱，放置1 min后以10000 rpm 离心1 min；重复此步骤，最后为86l。5. 取1l电泳检测，另取1l稀释10倍后测OD值。6. 加1/10V的3M PH5.5的NaOAc和3V体积无水乙醇，-80 30min-2小时。7. 10000rpm 4离心30min，弃上液，加75%乙醇 400ul洗，再10000rpm 4离心3min，弃上液，适当晾干5min，溶解于9ul Rnase free水中（冰浴放置30min-2小时）。（四）mRNA fragmentation1. 将9ul的mRNA样品转移到200ul PCR专用tube管中，再加10XFragmentation Buffer（Ambion，#AM8740）1ul，放置于PCR仪70度5分钟。2. 加入1ul Stop Buffer（Ambion，#AM8740），立即置于冰上。3. 转移到1.5ml的tube管中，依次加入1ul 3M NaOAc（PH5.2），2ul glycogen（Ambion，#AM9510），30ul 100% EtOH，-80度放置30分钟。4. 以14000rpm 4度离心25分钟沉淀，弃上液，加75%乙醇 400ul洗，再10000rpm 4离心3min，弃上液，适当晾干5min，溶解于10.5ul Rnase free水中（冰浴放置30min-2小时）。（五）First strand cDNA synthesis1. 将10.5ul样品转移到200ul PCR专用tube管，然后加入1ul Random Hexamer Primers（3ug/ul，Invitrogen，#48190-011），在PCR仪65度放置5分钟，立即置于冰上。2. 准备以下的mixture，充分混合，保证能提供7.5ul mixture至一个样品。依次5X first strand buffer（Invitrogen，#18064-014）4ul；100mM DTT（Invitrogen，#18064-014）2ul；dNTP mix（10mM）1ul；RnaseOUT（40U/ul）（Invitrogen，#10777-019）0.5ul3. 将7.5ul mixture加入样品中，充分与样品混合，25度放置2分钟。4. 加1ul SuperScript II（200U/ul，Invitrogen，#18064-014）到样品中，按以下程序依次加热或置冷：25度10分钟-42度50分钟-70度15分钟-4度hold（以上每个样品实际量为20ul）（六）Second strand cDNA synthesis1. 直接在样品加入51ul水。2. 依次加入5XSecond strand buffer（Invitrogen，#10812-014）20ul，dNTP mix（10mM）3ul，充分混合，再冰上放置5分钟。3. 加入RNaseH（2U/ul，Invitrogen，#18021-014）1ul，DNA Pol I（10U/ul，Invitrogen，#18010-025）5ul，充分混合，在PCR仪16度放置2.5小时。（以上每个样品实际量为100ul）4. 进行样品DNA纯化（Qiagen，#28106）：即每个样品中加500ul PB，转入柱子中，12500rp