总RNA的提取测定及逆转录.doc

总RNA的提取及测定（Trizol法）(1)组织匀浆取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研至粉末状。每50-I00mg匀浆组织标本加入lml的Trizol继续研磨。（标本的量不能超过Trizol体积的10%，否则会出现DNA污染。）将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15-30放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。（或-70C过夜后再进行）(2)相分离加入0.2ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇荡巧秒，在15-30放置2-3分钟，然后4离心12000g，15分钟。离心后分成3层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层（DNA和蛋白质），上层是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总Trizol的60%。(3)RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的1.5mlEP管中，加入0.5ml异丙醇，轻柔上下颠倒混匀，15-30静置10分钟，然后4，12000g离心10分钟。在管的侧壁和底部可看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。(4)RNA洗涤弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，轻弹管壁使RNA沉淀漂浮，4，7500g离心5分钟。(5)RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，(不能在真空中离心干燥。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。)根据RNA的量，用DEPC水（20-60l）重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟。(6)测定RNA浓度:2l DEPC水2次调零。2l样品测其RNA浓度。A260/A280的值在 1.8-2.0范围视为纯度很高。（RNA于-70C保存）逆转录(RT)取2g总RNA加入ll随机引物，用DEPC水补充体积为15l。70C反应5分钟，置于冰上。加入以下反应体系：5xM-MLV逆转录缓冲液 5ulM-MLV(200U/ ul) 1ul4xdNTP(10mol/L) l.25ulRNasin(40U/ ul) 0.6ulDEPC水 2.25ul总反应体积25ul置于PCR扩增仪中2510分钟，3760分钟，955分钟终止反应。逆转录产物加80ul灭菌ddH20混匀并分装，于-20保存。PCR及琼脂糖凝胶电泳PCR反应体系：TakaRaExTaqDNA聚合酶 0.25 ul 0.25 ul10XReaetion Buffer 5 ul 5 ul4XdNTP 4 ul 4 ulPrimer1 1 ul 0.6 ulPrimer2 1 ul 0.6 ul待测 cDNA 1 ul 1 ul灭菌ddH2O 37.75 ul 38.85 ul总体积 50 ul 50 ul2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物是否为特异目的片段：称取琼脂糖0.6g放入200ml三角烧瓶中，加入30ml 1xTBE溶液，加热令其完全溶解，待冷却至约60时加入2ul溴化乙锭溶液(10mg/ml)，浇板，水平放置，避光待凝。将已制备的2%琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入 1xTBE至高出凝胶表面1mm。10 u1 PCR产物分别和2 ul 6x加样缓冲液混匀后上样电泳，另取6ul DNA LadderMaker作为DNA片段大小的对照。80V-120V电压下电泳20-30分钟。所需试剂RNA提取（1） RNA提取试剂TRIZOL：Invitrogen公司（2） 焦碳酸二乙酯（DEPC）：Sigma公司（进口分装）（3） 氯仿（4） 异丙醇（5） 75%乙醇:无水乙醇加DEPC水配制（6） 核糖核酸酶抑制剂（RNAsin）：华美生物工程公司逆转录（7） 随机引物：上海生工生物工程公司（8） dNTP：北京天为时代公司（9） M-MLV逆转录酶：Promega公司（10） M-MLV逆转录缓冲液（11） DEPC水（12） TakaRaExTaq DNA聚合酶：宝生物工程有限公司（13） 目的基因引物：上海生工生物工程公司（14） 10*Reaction Buffer（15） dNTP：北京天为时代公司PCR（16） 灭菌ddH2O（17） 琼脂糖：上海鼎国生物工程公司（西班牙进口分装）（