生物工程下游技术.doc

填空题1. 超声波破碎细胞的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关。2. 目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种: 微孔过滤(微滤)、超滤、 反渗透。3. 在生物工程下游技术领域， 色谱 和 电泳 是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。4. 无论是什么类型的液相或气相色谱,其色谱装置均应包括: 流动相供给、 进样、 色谱柱、 检测器 等四大部分。5. 在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法： 一种是维持流动相热力学参数不变的 等梯度洗脱法，另一种叫 梯度洗脱法。6. 评价HPLC色谱填料性能的主要表征指标包括：（每空0.5分） 保留值， 选择性 , 柱效率， 填充柱的空喜和穿透性 ,分离度 。7. 请列举任意四种破碎细胞的方法：（每空0.5分） 高压匀浆法 ， 高速珠磨法 ，超声破碎 化学渗透法 。8. 在HPLC领域内经常可以遇到的吸附等温线可以有以下5种（形状）:（每空0.5分） 凹形， , 凸形 ， , S形，H形 ， 阶梯形 。9. 羟其磷灰石在原理上一般被认为是一种 弱离子交换 色谱。（本小题1分）10. 请列举二种测量蛋白质含量的方法 考马斯亮蓝法 ，克氏定氮法 。（ 每空1分）。11. 常见的无机色谱填料主要包括： 硅胶 、 可控孔径玻璃 、 氧化铝 、 氧化钛 、 羟基磷灰石 以及 碳 和 石墨 等基质。12. 无机HPLC填料最常见的是以 多孔硅胶 为基本材料的填料；含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃经过热处理引起相分离，生成可溶于酸的 Na2O-B2O3 相及不溶于酸的 高硅 相。将酸可溶相浸析出来后剩下的另一相就制成了可控孔径玻璃，可控孔径玻璃的主要化学成份就是 二氧化硅 。13. 不同分子量的蛋白质在电场中的迁移速度与其所带的 静电荷数 成正比，与它本身的 半径 及溶液的 粘度 成反比。(每空1分)14. 径向色谱填料主要有：离子交换树脂 和 亲和色谱填料 两种。15. 溶质保留置换理论的核心是： 当一个溶质被吸附剂西湖时,在溶质份子和吸附剂接触的表面必然会释放出一定数目的溶剂分子 。(本小题3分)18 指出三种交联葡聚糖的微载体：Cytodex1微载体；Cytodex 2微载体；Cytodex 3微载体19 指出蛋白质复性的三种方法：稀释法，透析法，液相色谱法等20固液分离的主要方式包括：离心法，过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。21膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜22 色谱的保留值可以用 保留时间也可以用 保留体积来表示。23色谱的峰宽可以用半峰宽、峰底宽、标准偏差表示。25线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形。从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、S形的色谱图是波浪形的。30离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。32目前径向色谱柱使用的填料主要有离子交换树脂和亲和色谱两种;33蛋白质含量和纯度测定方法。含量测定:克氏定氮法，TCA比浊度法、双缩脲法、福林-酚法和紫外线法，考马斯兰法（Bradford法）。纯度衡量:电泳法，层析法，质谱法等。一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。34细胞破碎法包括：机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括：液体剪切力和固体剪切力方法，液体剪切力包括：高压匀浆法和超声破碎法；固体剪切力包括：高速珠磨法和压榨法。35高压匀浆法的主要困难包括：温控和堵塞问题26高压匀浆法的破碎率决定于：匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数。34蛋白质的分子量测定：超离心法：光散射方法：凝胶过滤法：SDS-PAGE电泳法：一、 简答1、 细胞破碎的方法有哪些？机械破碎：通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法、研磨法、匀浆法、超声法 物理破碎：通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法、压力差破碎法化学破碎：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎。有机溶剂、表面活性剂、酸碱酶促破碎：通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法、外加酶制剂法2、 比较凝聚和絮凝？凝聚：指在中性盐（铝、铁的盐类）作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体脱稳并使粒子相互聚集成mm 大小块状凝聚体的过程。絮凝：指使用高分子絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10 mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。3、 气液色谱中色谱柱中载体有哪些特点？1、不溶性；2、渗透性，即具有疏松的网状结构，容许大分子自由通过；3、高硬度及适当的颗粒形式，最好为均匀的珠状；4、最低的吸附力；5、较好的化学稳定性；6、抗微生物和酶的侵蚀；7、亲水性；8、具有大量的供反应的化学基团，能与大量配基共价连接。5、双水相萃取的特点1）操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行，利于保持生物分子的活性；2）双水相萃取克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的缺点。3）双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，回收效率高。4）不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体无害；6、发酵液预处理的目的？ 提高从悬浮液中分离固形物的速度和固液分离的效率 改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度； 尽可能使产物转移到液相 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质)； 电渗析：利用待分离分子的电荷性质和分子大小的差别，以外电场电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；电渗析的应用：工业上多用于海水、苦咸水淡化和废水处理；生物分离中可用于氨基酸和有机酸等小分子的脱盐和分离纯化。9、酶解法细胞破碎的优缺点？优点：1）发生酶解的条件温和2）能选择性地释放产物3）胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：1）溶酶价格高2）溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)3）产物抑制的存在10、沉淀法优缺点？优点：1)操作简单；成本低；收率高；2)浓缩倍数高可达l0-50倍；3)不会使蛋白质等大分子失活缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强11、溶剂萃取法的特点？1)萃取过程有选择性；2)能与其它步聚相配合；3)通过相转移减少产品水解；4)适用于不同规模；5)传质快；6)周期短，便于连续操作；7)毒性与安全环境问题。14、化学渗透法细胞破碎的优缺点？优点：1）对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；2）细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。缺点：1）通用性差； 2）时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 3）有些化学试剂有毒； 4）化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。16、影响盐析的因素？1）蛋白质种类的影响；2）蛋白质浓度的影响；3）无机盐的种类；4）pH值；5）盐析温度。填空题1.超声波破碎细胞的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及细胞类型等因素有关。3在生物工程下游技术领域， 色谱 和 电泳 是目前所知最好的两种分离蛋白的方法。5无论是什么类型的液相或气相色谱,其色谱装置均应包括: 流动相供给、 进样、 色谱柱、 检测器 等四大部分。7径向色谱填料主要有： 离子交换树脂 和 亲和色谱填料 两种。9请列举任意四种破碎细胞的方法： 高压匀浆法，高速珠磨法，超声破碎，酶溶法。11请列举二种测量蛋白质含量的方法：双缩脲法 ，考马斯蓝法 。17羟基磷灰石在原理上一般被认为是一种无机基质高效色谱。19指出蛋白质复性的三种方法：稀释法，透析法，液色色谱法等21膜的孔径一般为微米级，依据其孔径的不同（或称为截留分子量），可将膜分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜23色谱的峰宽可以用半峰宽、峰底宽、标准偏差表示。26Shepadex G25是一种凝胶排阻色谱，主要用于脱盐。34细胞破碎法包括：机械力和非机械力破碎方法；机械方式又包括：液体剪切力和固体剪切力方法，液体剪切力包括：高压匀浆法和超声破碎法；固体剪切力包括：高速珠磨法和压榨法。26高压匀浆法的破碎率决定于：匀浆阀的结构，操作压力，破碎次数。2目前用于固液分离的膜过滤法主要有以下三种: 微孔过滤(微滤)、超滤、 反渗透。4在生物物质分离中，可以依据一次进样量多少，将色谱分为： 分析色谱、 半制备色谱（中等规模制备色谱）、制备色谱 和工业生产规模色谱 4大类。6在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱上洗脱下来的方法： 一种是维持流动相热力学参数不变的 等梯度洗脱法，另一种叫 梯度洗脱法。8评价HPLC色谱填料性能的主要表征指标包括： 保留值，选择性，柱效率，填充柱的总空隙度和穿透性，分离度。 10在HPLC领域内经常可以遇到的吸附等温线可以有以下5种（形状）:凸形、凹形、S形、H形、阶梯形12常见的无机色谱填料主要包括：多孔硅胶、可控孔径玻璃、氧化铝、氧化钛、 羟基磷灰石 以及 碳 和 石墨 等基质。15不同分子量的蛋白质在电场中的迁移速度与其所带的净电荷数成正比，与它本身的半径及溶液的黏度成反比。18 指出三种交联葡聚糖的微载体：Cytodex1微载体；Cytodex 2微载体；Cytodex 3微载体20固液分离的主要方式包括：离心法，微孔膜过滤法，双水相萃取，泡沫分离法。25线性色谱的吸附等温线是直线，非线性色谱的吸附等温线的形状常见的有：凸形、凹形、S形、H形、阶梯形。从吸附等温线的形状可以预见色谱曲线的形状，一般凸形的吸附等温线代表色谱图是拖尾的，凹形吸附等温线代表的色谱图是吐舌头形状、S形的色谱图是波浪形的。27 Shephadex G100是一种凝胶排阻色谱，主要用于蛋白质的纯化。28DEAE-Shaphdex A25是一种离子交换层析介质。29CM-纤维素是一种弱阳离子交换介质。30离子交换层析一般是通过梯度一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。31QAE-葡聚糖是强碱阴离子交换剂，SP是强酸阳离子交换剂。33蛋白质含量和纯度测定方法。含量测定:克氏定氮法，TCA比浊度法、双缩脲法、福林-酚法和紫外线法，考马斯兰法（Bradford法）。纯度衡量:电泳法，层析法，质谱法等。一般应采用二种以上方法，而且同一原理的方法不应该采用二次。35高压匀浆法的主要困难包括：温控和堵塞问题34蛋白质的分子量测定：超离心法、光散射方法、凝胶过滤法、SDS-PAG、电泳法。判断1.微波加热法破碎细胞特别适合于对热不稳定的的产物的提取。2.利用液相色谱方法对包含体蛋白质进行复性比稀释复性法优越.3.浓差极化是一个可逆的过程。4.层析系统中,有效柱长最短柱长是使最难分离的一对溶质将达到完全的基线分离的必要条件. 5.层析过程中,有效柱长是随层析条件的变化而变化的. 6.分析色谱是线性色谱；7.只要样品进样量足够大，色谱过程就是一种非线性色谱。8.生化用离子交换树脂的电荷密度越大，其分离效果越好。9.样品中蛋白质的纯度为99%，说明该样品中目标蛋白质的含量为样品总量的99%。10.所有的蛋白质电泳都是利用不同蛋白质带的电荷的差异而达到分离不同蛋白质目的的。11.葡聚糖凝胶排阻色谱中，上样量越大，分辨率越高。12.凝胶排阻色谱的层析柱越长越好。13.HPLC填料的颗粒分散范围越窄越好。14.非线性色谱的样品的保留值是可变的。15.为了减小样品在洗脱过程的轴向扩散，可采取增大进样浓度减少进样量的方式。16.作为动物细胞培养的优良微载体应该是刚性的。17.高速珠磨法比高压匀浆法破碎细胞的效果好。18.色谱过程中试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础。19单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。1.凝胶过滤操作中，通常上样量越小，分辨率越高。2.一旦液料开始与膜接触，膜污染就开始发生。3.膜污染是一个可逆的过程。4.层析系统中,当实际柱长最短柱长, 则该分离过程不能达到物质的有效分离. 5.层析过程中,可以通过改变洗脱剂的浓度变化梯度改变有效柱长和最短柱长. 6.制备型色谱是非线性色谱。7.非线性色谱的保留值是可变的，峰形是不对称的，峰高与样品量不成正比关系。8.HPLC填料的颗粒粒度的分布应该是越小越好的，最好是能实现颗粒的单分散。9.实验室可以使用SDS-PAGE电泳测量蛋白质的分子量。11.同一蛋白质在不同种类的缓冲液中，只要缓冲液的pH值相同，则蛋白质所带的电荷数量也相同。12.细胞破碎过程应尽量彻底，使细胞碎片尽可能越小越好。13.利用聚赖氨酸/海藻酸系统进行的细胞微囊化培养，所形成的微囊外膜的孔径的大小主要是由聚赖氨酸的分子量所决定的。14.非线性色谱的层析峰形一般来说是高斯正态分布的对称峰。15.动物细胞培养一定要采用贴壁培养的方式。16.动物细胞培养微戴体的密度应略大于培养基。17.一般讲，亲水性膜及膜材料电荷与溶质相同的膜较耐污染。18色谱过程一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢。19.用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。20.分离度是由色谱柱的柱效所决定的。完成图表细胞破碎的方法分类 破碎方法 机械法 非机械法 固体剪 液体剪 干燥 液胞作用切作用 切作用 处理珠磨法 压榨 高压匀浆 超声破碎 酶溶法 化学法 物理法填空题 1、 膜分离技术的主要种类有微滤；超滤；反渗透；电渗析；渗透蒸发等五种类型。2、 动物细胞培养的操作方式可分为分批式操作；流加式操作；半连续式操作；连续式操作；灌注式操作等五种方式。3、常用的液相色谱蛋白质复性法有体积排阻色谱法；离子交换色谱法；亲和色谱法；疏水作用色谱法4、按照基质材料组成可将微载体大致分为交联葡聚糖为基质的微载体；纤维素为基质的微载体；蛋白质为基质的微载体；高分子合成材料为基质的微载体；无机材料玻璃为基质的微载体；液膜微载体。问答题所谓的树脂“中毒”现象是指离子交换树脂受被分离液中蛋白质或其它杂质，以及自身结构等因素的影响，使得离子交换树脂在工作过程中出现工作容量下降和难以洗净等影响分离效果的现象。优良的微载体应具有如下特性： 不含有毒害细胞的成分。 与细胞有良好的相容性，使细胞容易贴壁。 微载体密度应略大于培养基。 粒径有严格的范围要求，表面光滑以利于细胞铺展。 具有良好的光学透明性，便于显微镜观察细胞生长情况。 能