大肠菌群测定步骤.doc

食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。2、证实试验用直径3mm的接种环从上面1中所有24h和48h内发酵产气的LST肉汤管中分别挑取培养液1环，分别移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，于360C+10C培养48h+2h，记录所有BGLB肉汤管的产气管数，根据BGLB肉汤的产气管数查MPN表，并按四（1）报告结果。3.粪大肠菌群的测定用直径为3mm的接种环从上面1中所有48h+2h内发酵产气的LST肉汤管中分别挑取培养液1环，转种于EC肉汤管中并放置于带盖44.50C+0.50C的恒温水浴箱内，培养24h+2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。记录EC肉汤管的产气情况，产气管为粪大肠菌群阳性；不产气为阴性。根据粪大肠菌群的阳性管数查MPN表（见附录1）并按四（1）报告结果。三、大肠杆菌的测定（MPN法）1、培养将2.3中EC肉汤管在44.50C+0.50C恒温水浴箱内培养24h+2h后，从产气管中挑取培养液划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，360C+10C培养24h+2h。2、检查检查平板上有无黑色中心、有光泽或无光泽的可疑菌落。用接种环蘸取菌落中心部位并转种于营养琼脂斜面上，360C+10C培养18h24h。3、试验将营养琼脂斜面培养物转种于下列生化培养基中进行试验。（1）色氨酸肉汤（靛基质试验）：360C+10C培养24h+2h后，加Kovacs氏试剂0.20.3，上层出现红色者为靛基质试验阳性。（2）MR-VP培养基：360C+10C培养48h+2h后，无菌操作移取培养物1ml至13mm*100mm试管中，加5%a-萘酚乙醇溶液0.6ml，40%氢氧化钾溶液0.2ml和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分继续培养48h后滴加5滴甲基红溶液，如果培养物变红则表示甲基红试验阳性，变黄则为阴性。4、Kovser氏柠檬酸盐肉汤：360C+10C培养96h后，观察其生长情况。5、LST肉汤：360C+10C培养48h+2h后，观察其产气情况。6、革兰氏染色：取营养琼脂斜面培养物进行革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。7、大肠杆菌和非大肠杆菌生化鉴别如下表，如出现表中以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。 表1 大肠杆菌和非大肠杆菌生化鉴别表靛基质MRVP柠檬酸盐鉴定（型别）+-+-典型大肠杆菌非典型大肠杆菌+-+-+典型中间型非典型中间型-+-+典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌8、大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMCIC试验为+-或-+-。根据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附录1）