用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱 High Re.pdf

遗传 H E RE D I T A S B e i j i n g 1 9 3 4 4 4 8 1 9 9 7 用荧光原位杂交技术构建高分辨率的D N A物理图谱 钟筱波P a u l F F r a n s z J Ha n s d e J o n g P i m Z a b e l 荷兰瓦赫宁根农业大学分子生物学系 Hi g h R e s o l u t i o n P h y s i c a l Ma p p i n g b y F l u o r e s c e n c e i n s i t u Hy b r i d i z a t i o n Z h o n g Xia o b o P a u l F F r a n s z J Ha n s d e J o n g a n d P i m Z a b e l D e p a r t me n t o f Mo l e c u l a r B i o l o g y Wa g e m n g e n A g r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y T h e N e t h e r l a n d s D N A序列在染色体上的定位和分子图 谱 m o le c u la r m a p 的构建是克隆目的 基因的 基础 用 常规分子生物 学技术构建分子图请是基于对 D N A分子标记 m o le c u la r m a r k e r 如 R F L P R A P D A L F P 等的遗传分析 从中找出不同 D N A序列之间的连锁遗传关系和相关位置 这种分析方法的准确性和图诺的分辨率 r e s o l u t io n 水平将取决于染色体减数分裂时DN A的重组率 m e io t ic r e c o m b in a t i o n 但由于重组 率在染色体 上 的 分 布是 不 均 匀 的 S h e r m a n和 S t a c k 1 9 9 5 发 现 靠 近 着 丝 点 c e n t r o m e r e 的 异 染 色 质 h e t e r o c h r o m a t i n 区的D N A重组率要比 远离着丝点的同染色质 e u c h r o m a t in 区低很多 这样就会造成两个 分子标记之间的遗传距离 g e n e t ic d is t a n c e 由于在染色体上的位置不同而与真实的物理距离 p h y s i c a l d is t a n c e 发生偏差 因此 人们需要一些更准确的技术来弥补这种偏差 近年来 随着 D N A荧光原位杂交技 术 F lu o r e s c e n c e i n s it u h y b r id i z a t io n 缩 写为F I S H 的 不断 发展 一 种更 直接的 在染色 体甚至D N A纤 维 e x t e n d e d D N A f ib r e 水平上直接构建分子图谱的新方法正不断走向 成熟 D N A荧光原位杂交技术是 8 0 年代末才开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术 它的基本原理 是将 D N A探针用特殊修饰的核昔酸分子标记 如 b io t in d U T P 或 d ig o x ig e n in d U T P 然后将标记的探针直接 原位杂交到染色体或 DNA纤维切片上 再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特性结合来检测 D NA 序列在染色体或 D N A纤维上的定位 F I S H技术与其它原位杂交技术相比 除了 具有不需要放射性同位素 实 验周期短 检测灵敏度高等优点外 还由于它可以用不同的修饰核昔酸分子标记不同的 DN A探针 再用不同的 荧光素分子检测不同的探针分子 因此 可以在荧光显微镜下在同一张切片上 同时观察几种 DN A探针的定位 直接得到它们的相关位置和顺序 R ie d 等 1 9 9 2 用3 种不同 标记的核昔酸 以不同的比例混合标记 在人的 有丝分裂中期染色体 m it o t ic m e t a p h a s e c h r o m o s o m e 上可以同时检测到 7个 D N A探针 D a u w e r s e 等 1 9 9 2 已 将 F I S H技术发展到可同时检测 1 2 种 D N A探针分子 目前 F I S H 已 成为一 种最直接分析D N A序 列 在染色体或D N A分子上排列的分子细胞遗传学技术 它已 被广泛地应用于动植物基因组结构 g e n o m e o r g a n iz a ti o n 的研究和D N A分子物理图谱 p h y s ic a l m a p 的构建 参见J o o s 等1 9 9 4 J ia n g 等1 9 9 4 H e is k a n e n 等 1 9 9 6的综述 在用 F I S H 技术构建 DNA分子图谱时 它的分辨率 r e s o l u t i o n 是指两个不同 DNA探针能够被检测到 的最小距离 也是最关键的 技术指标 它将决定分子图谱的准确性和精密程度 在决定F I S H分辨率的因素中 最重要的是所使用的靶 D NA在染色体或 D NA纤维上的浓缩度 c o n d e n s a t i o n 亦即 DNA在染色体结构或 DN A纤维上的三维空间包裹程度 浓缩度越高 分辨率越低 F I S H技术的发展过程也正是分辨率水平由低向 3 期钟筱波等 用荧光原位杂交技术构建高分辨率的 DNA物理图诣4 5 高 不断进步的历程 本文将结合对F I S H技术在不同染色体或 D N A纤维 切片 上的分辨率水平的分析 阐述这项 技术在构建高分辨率的分子图谱中的应用前景 1 在中期染色体上的荧光原位杂交 早期的荧光原位杂交技术多以中期染色体作为靶D N A的载体 一方面它 是传统遗传学的基础 另一方面制 片 技术也比较容易掌握 许多人都曾成功地在中 期染色体上用 F I S H技术构建了染色体分子图谱 一个 典型的例 子 是 L ic h t e r 等 1 9 9 0 选用了5 0 个人类第 1 1 条染色体的 c o s m id 克隆 在人的中期染色体上进行荧光原位杂 交 排列出所有探针在染色体上的顺序 进一步 他们用两 个或更多的探针同时进行原位杂交来判断较近的 D N A序列之间的相对关系 由此构建出人类第 1 1 条染色体的分子图谱 但他们同时发现 由于使用的中期染 色体已是 DN A和蛋 白质高度重益和缠绕后的复合体 如果两个探针之间的距离小到一定程度之后 F I S H技术 就不能分辨出它们之间的相互关系 而这个分辨率的水平在人的中期染色体上大约是 1 3 Mb 百万碱基对 之 间 类似的结果在不同的动植物种类中都有报道 L a w r e n c e 等 1 9 9 0 T r a s k 等 1 9 9 2 然而 对于克隆一个只有 几k b 长度的基因来说 l v 3 Mb 的分辨率水平是远不够的 另外 中期染色体还有一个缺点 由于染色体商度 浓编 对于一些基因组较小的种类 如酵母 A r a b id o p s i s 番茄 水稻等 在光学显微镜下很难根据每条染色 体的结构分辨出单条染色体 这也给构建图谱带来困难 要提高 F I S H技术的分辨率水平 人们很容易想到使用浓缩度低的染色体作为靶 DNA的载体 有人考虑到 使用 有丝分裂前期染色体 m i t o t ic p r o p h a s e c h r o m o s o m e s I n a z a w a 等 1 9 9 4 报道通过同步化处理 可从人 的淋巴细胞中得到拉长的前期染色体 在一个 3 6 0 k b的 D NA分子区域 内 用两色 F I S H技术在这种前期染色体 上能够准确地观察到两个相距 1 7 5 k b的探针被分离开 但这种染色体切片不容易制备 而所能提高分辨率的能 力 有限 因此 用这种染色体切片进行荧光原位杂交的报道并不多见 H a a f 和 Wa r d 1 9 9 4 发展了一项技术 可用离心机械力将中期染色体拉长 5 2 0 倍 在这种拉长的中期染色体上进行荧光原位杂交 可将分辨率水平提 高到 2 0 0 k b左右 但利用这种受机械力拉长的中期染色体 其染色体结构可能会受到一定程度 的破坏 并且不 同区域的染色体拉长的程度也可能不同 会给图谱的准确性带来人为的干扰 2在减数分裂粗线期染色体上的荧光原位杂交 在分析了 有丝分裂和减数分裂所有时期染色体的结构特征和进行高分辨率 F I S H的可能性之后 我 们发现减 数 分裂粗线期 p a c h y te n e 是最理想的时期 Z h o n g 等 1 9 9 6 a 和Z h o n g 等 1 9 9 6 b 这一时期的染色体已 经完 成了同源染色体的配对 利用特殊的 制片 技术 可以 分离到单条染色体 其长度通常比 相应的中期染色体长 1 0 一2 0 倍 而这一时期染色体的形态也十分特殊 着丝点 c e n t r o m e r e 和端粒 t e l o m e r e 结构很容易识别 并 且每条染色 体的异染色质 h e t e r o c h r o m a t in 和同染色质 e u c h r o m a t in 区都有可识别的结构特征 以番茄为 例 R a m a n n a 和 P r a k k e n 早在 1 9 6 7 年就建立了一套根据粗线期着丝点的位置 短臂和长臂的比 例以 及异染色 质和同染色质的结构特征来识别 1 2 条番茄染色体的方法 不久前 我们发展了一种从番茄花药的花粉母细胞 中 制备粗线期染色体的技术 能够分离到不带细胞质的单条粗线期染色体 并能根据 Ra m a n n a的方法识别出每条 染色体 用番茄染色体的端粒重复序列 te lo m e r i c r e p e a t 和端粒联接重复序列 t e lo m e r e a s s o c i a t e d r e p e a t 作为探针 在这种染色体上进行两色荧光原位杂交 证实其分辨率能够达到低于 1 0 0 k b的水平 Z h o n g 等 1 9 9 6 b 由 此可见 以粗线期染色体作为靶D N A载体 不仅可以在不破坏染色体结构的情况下大大提高F I S H 的分辨率 还可弥补中期染色体不能识别单条染色体的缺陷 不过 F I S H在粗线期染色体上的 应用还要取决于 制片技术的难易程度 对于有些动植物种类 提取性细胞是很困难的 遗传 H E R E D I T A S B e ij in g 1 9 9 7 1 9卷 3在间期细胞核上的荧光原位杂交 在制备染色体切片时 很容易得到大量的间期细胞核 这些细胞核没有典型的染色体结构 但其染色质在这 一时期却 比分裂时期的染色体浓缩程度低很多 荧光原位杂交的分辨率 也会比染色体 高很多 L a w r e n c e等 1 9 8 8 首先观察到两个 D N A探针的实际距离与在间期细胞核上的荧光原位杂交信号的距离有一定的关系 T r a s k 等用一系列的实验证实间期细胞核上的荧光原位杂交可以用于构建高分辨率的分子图请 通过对从 5 0 k b 到 1 Mb 范围里的 D N A探针序列的间期细胞核荧光原位杂交分析表明D N A序列在间期细胞核的距离与 D N A 分子的直线距离有很强的相关性 T r a s k 等 1 9 8 9 两个相距 5 0 k b 的D N A序列能够在间期细胞核中 检测到信号 分离 用三色间期细胞核荧光原位杂交技术 T r a s k 等 1 9 9 2 测定出 5 0 0 k b 范围中三个探针的相关顺序和之间 的 距离 但D N A序列在间期细胞核的距离与D N A分子的直线距离的 相关性在超过 2 Mb 之后相应减弱 这可 能与间期细胞核 中染色质的三维空间结构有关 尽管染色质上的 DNA结构已比染色体上的浓缩度降低了许多 但它仍保持着细胞中原有的空间结构 这种结构决定了 F I S H的分辨率水平只能达到 5 0 k b左右 4在游离染色质上的荧光原位杂交 要突破F I S H分辨率的限制 须考虑人为 地改变染色质的原有空间结构 H e n g 等 1 9 9 2 首先提出 用碱 性溶胞剂 a l k a lin e ly s i s b u f f e r 对处于GI 和 G 2 期之间的间期细胞核进行处理 释放出游离的染色质丝 f r e e c h r o m a t in 这种染色质丝已 经失去了原有的细胞空间结构 其 D N A的浓缩度更进一 步降低 在对 3 5 0 k b 范围 里的5 个c o s m id 克隆进行F I S H定位之后 两个 相距 2 1 k b 的克隆能够在游离染色质上完全被分开 杂交信号之 间的距离与 DNA的实际距离之间存在良好的线性关系 根据实验统计 每微米游离染色质丝大约相当于 8 0 k b 的 DNA分子长度其 F I S H分辨率的水平能接近 I O k b 可用于分析 1 Mb范围内 D NA序列的位置关系 5在 DN A纤维上的荧光原位杂交 游离染色质丝尽管已经失去了原有的细胞空间结构 但它仍是 D N A和蛋白 质的复合大分子 其染色质的基 本 结构核小体和组蛋白并没有遭到破坏 在 H e n g 等人 1 9 9 2 的思路的基础上 Wie g a n t 等 1 9 9 2 P a r r a 和 Wi n d l e 1 9 9 3 进一步想到用更强的变性剂对染色质丝进行处理 让 DNA分子完全从蛋白质中分离出来 制备 出D N A纤维 e x t e n d e d D N A f ib r e Wie g a n t 等用一种含高 浓度盐和一定量的变性剂 d e t e r g e n t 的 碱性缓冲 液对间期细胞核进行处理后 得到一种被称为H a l 的D N A纤维结构围绕在细胞核周围 这是一些环状 D N A 分子片 段 通常有 4 0 0 5 0 0 k b 长 可以用来作为高分辨率的F I S H的靶 D N A F l o r ij n 等 1 9 9 5 用这种 H a l o 切片对4 0 0 k b范围内的c o s m id c o n t ig 进行 F I S H图 谱定位之后 发现其分辨率水平能达到低于 1 k b P a r r a 和 Wi n d l e 使用的技术略有不同 他们将游离的单细胞培养液涂在载玻片上 然后用一种含有 S DS和 E DT A的 ly s is b u f f e r 溶解细胞 5 分钟 再将载玻片倾斜至 4 5 度角 随着缓冲液的向下流动 直线的 D N A纤维分子便从 细胞中拉出 在这种 D N A纤维上进行多色 F I S H 能够直接观察到 3 5 k b 的质粒 D N A p la s m i d 探针在 D N A分子上的直线排列 这时观察到的荧光杂文信号已不再是单个的点 而是由许多点组成的线 探针分子的 长度能够通过对荧光信号长度的测量来推算 并且不同D N A序列之间的重叠 o v e r la p 和间隔 g a p 都能直 接在显微镜下看到 在 1 Mb的 DN A范围里 F I S H定位的分辨率能够到达 1 一2 k b 与常规分子生物学的限制 性内切酶图请法 r e s t r ic t io n m a p p i n g 差不多 但它具有更快速 更直接 更简便的优点 进一步 H e i s k a n e n等用脉冲 电泳 P F GE 分 离大分子 D NA 再从含有 大分子 DN A 的葡 聚糖胶块 a g a r o s e b lo c k s 中提出D N A分子 直接在载玻片上制备 D N A纤维 这种 D N A纤维分子同样适用于 F I S H 它暗示从脉冲电泳中分离的 5 0 k b到 2 Mb的 D N A大分子 如人造醉母染色体 y e a s t a r t i fi c ia l 46 3 期钟筱波等 用荧光原位杂交技术构建高分辨率的 D N A物理图 谱4 7 c h r o m o s o m e s 缩写为 Y A C DNA可以直接作为 F I S H的模板 DNA分子 用于构建 DN A分子图谱 这样将 会大大简化图谱构建的过程和加快图谱构建的速度 在 DNA纤维上进行 F I S H在人和动物上发展四年之后 这一技术也被我们成功地引入植物 F r a n s z 等 1 9 9 6 由于植物细胞具有与动物细胞明显的不同特点 如果用单细胞作为制备 D N A纤维的材料 植物细胞的 细胞壁将会是一个 很大的障碍 为了 克服这个困难 我们首先从叶片中提出游离的 细胞核 再将这些细胞 核涂在 载玻片上 通过 y s is b u f f e r 的处理 能够得到直线的 平行的D N A纤维 在这种纤维分子上 我 们能 够看到 高 度重复的 核糖体 r ib o s o m a l D N A的组织结构 能够直接排列和定位c o s m id 克隆和噬菌体克隆 图谱的分 辨率水平能达到 l k b 左右 检测信号的灵敏度低于 7 0 0 b p 比较各种制备 D N A纤维的 方法 无论是人和动 物还 是植物 所得到的 D N A纤维的分子结构都十分类似 D N A纤维的展开度 s t r e t c h i n g d e g r e e 都在 3 0 3 5 k b M m之间 Wie g a n t 等 1 9 9 2 H o u s e a l 等 1 9 9 4 H a a f 和 Wa r d 1 9 9 4 F lo r ij n 等 1 9 9 5 F r a n s z 等 1 9 9 6 这一数值已十分接近 Wa t s o n 和C r ic k 建立的D N A双螺旋结构的理论值 2 9 4 k b p m 这说明 所得到的D N A纤 维很可能已是分离出的没有蛋白质复合的 DNA大分子 综上所述 由于所使用的靶 DNA切片的染色体或 DN A分子结构的不同 F I S H技术所能达到的分辨率水 平有很大的差别 以番茄染色体为例 粗线期染色体的浓缩度比中期染色体要低大约 1 0 1 5 倍 而DNA纤维比 中期染色体低 9 0 0 倍左右 这里我们对各种 F I S H技术的特点 包括分辨率水平 可检测 D NA序列的范围 以 及优点和缺点进行 了 总结和比较 见表 1 表1 在不同靶 D N A上荧光原位杂交技术的比较 靶 DN A结构 分辨率水平 可检测 DNA 序列范围 优点 和缺点 一 中期染色体 前期染色体 拉长的中期染色体 粗线期染色体 间期细胞核 游离染色质丝 DNA纤维 1 3 M b 2 0 0k b 2 0 0k b 1 00k h 5 0k b l Ok b l k b I M b 2 0 0 k b 2 0 0 k b 1 0 0 k b 5 0k b 2 M b l Ok b l Mb I k b 1M b 保持染色体结构 切片容易制备 分辨率水平低 识别染色体困难 一 保持染色体结构 分辨率水平居中 切片不易制备 识别染色体困难 一 保持染色体着丝点端粒结构 分辨率水平居中 拉长染色体不均匀 识别染色体困难 一 保持染色体结构 识别染色体可能 分辨率水平较高 切片不容易制备 一 分辨率水平高 切片容易制备 无染色体结构 一 分辨率水平高 无染色体结构 一 分辨率水平高 无染色体结构 一 高分辨率的 DN A荧光原位杂交技术能够快速准确地得到探针序列之间的顺序 方向和真实的物理距离 在 具体应用这一技术时 根据不同染色体和 DN A纤维的结构特征 选择适当的靶 DNA载体是很重要的 根据我 们的研究结果认为 如果从性细胞中制备粗线期染色体在技术上可行的话 在这种染色体切片上进行 F I S H 可 以 直接准确地找出与目的 基因相关的D N A探针克隆在染色体特定区域内 的定位 确定相距 I O O k b以 上的D N A 序列之间的顺序和相互位置关系 一旦 目的基因的范 围被缩小到 I O O k b以俊 可以直接在 DN A纤维上进行 F I S H 快速准确地构建出这一区域 的 DNA物理图谱 把在粗线期染色体和 D NA纤维上的 F I S H技术与现有 的分子生物学技术相结 合 将有效地加速大范围DN A物理图谱的构建 以及分离和克隆 目的基因的进程 4 8遗传 H E R E D I T A S B e ij i n g 1 9 9 7 1 9 卷 参考文献 I Da u u e r s e J G Wi e g a n t J e t a l Mu l t i p l e c o l o r s b y f l u o r e s c e n c e i i t t s i t u h y b r i d i z a t i o n u s i n g r a t i o 一 l a b e l l e d DNA p r o b e s c r e a t e a mo l e c u l a r k a r y o t y p e Hu ma n Mo l e c u l a r Ge n e t i c s 1 9 9 2 1 5 9 3 一5 9 8 2 F l o r i j n R J B o n d e n L A J e t a l H i g h r e s o l u t i o n DN A f i b e r 一 F I S H f o r g e n o mi c DNA m a p p i n g a n d c o l o u r b a r c o d i n g o f l a r g e g e n e s Hu ma n Mo l e c u l a r Ge n e t i c s 1 9 9 5 4 8 3 1 一8 3 6 3 F r a n s z P F A l o n s o 一 B l a n c o C e t a l Hi g h 一 r e s o l u t i o n p h y s i c a l ma p p i n g i n A r a h i d o p s i s t h a l i a n a a n d t o ma t o b y f l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n t o e x t e n d e d DNA f i b r e s T h e P l a n t J o u r n a l 1 9 9 6 9 421 430 4 Ga n a l M W L a p i t a n N L V Ta n k s l e y S D Ma c r o s t r u c t u r e o f t h e t o ma t o t e l o me r e s Th e P l a n t C e l l 1 9 9 1 3 8 7 9 4 5 Ha a f T Wa r d D S t r u c t u r a l a n a l y s i s o f a s a t e l l i t e DNA a n d c e n t r o me r e p r o t e i n s u s i n g e x t e n d e d c h r o ma t i n a n d c h r o mo s o me s Hu ma n Mo l e c u l a r Ge n e t i c s 1 9 9 4 3 6 9 7 一7 0 9 6 He i s k a n e n M Ka r h u R e t a l Hi g h r e s o l u t i o n ma p p i n g u s i n g f l u o r e s c e n c e u n s i t u h y b r i d i z a t i o n t o e x t e n d e d DN A f i b e r s p r e p a r e d f r o m a g a r o s e e m b e d d e d c e l l s B i o t e c h n i q u e s 1 9 9 4 1 7 9 2 8 一9 3 3 7 He i s k a n e n M P e l t o n e n L a n d P a l o t i e A Vi s u a l ma p p i n g b y h i g h r e s o l u t i o n F I S H Tr e n d i n Ge n e t i c s 1 9 9 6 1 2 3 7 9 3 8 2 8 H e n g H H Q S q u i r e J T s u i L C Hi g h 一 r e s o l u t i o n m a p p i n g o f m a m ma l i a n g e n e s b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n t o f r e e c h r o ma t i n P r o c Na t l Ac a d S c i US A 1 9 9 2 8 9 9 5 0 9 一9 5 1 3 9 H o u s e a l T W Da c k o w s k i W R e t a l H i g h r e s o l u t i o n ma p p i n g o f o v e r l a p p i n g c o s mi d s b y f l u o r e s c e n c e i i n s i t u h y b r i d i z a t i o n Cy t o me t r y 1 9 9 4 1 5 1 9 3 一1 9 8 1 0 I n a z a wa J Ar i y a ma T e t a l Hi g h r e s o l u t i o n o r d e r i n g o f DNA ma r k e r s b y mu l t i 一 c o l o r f l u o r e s c e n c e i u t s i t u h y b r i d i z a t i o n o f p r o p h a s e c h r o m o s o m e s C y t o g e n e t i c s a n d C e l l Ge n e t i c s 1 9 9 4 65 1 3 0 1 3 5 1 1 J i a n g 1 M Gi l l B S No n i s o t i p i c i i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n d p l a n t g e n o me ma p p i n g t h e f i r s t 1 0 y e a r s Ge n o me 1 9 9 4 3 7 一 7 1 7 一7 2 5 1 2 J o o s S F i n k T M e t a l Ma p p i n g a n d c h r o mo s o me a n a l y s i s t h e p o t e n t i a l o f f l u o r e s c e n c e t i n s i t u h y b r i d i z a t i o n J o u r n a l o f B i o t e c h n o l o g y 1 9 9 4 3 5 1 3 5 一1 5 3 1 3 L a wr e n c e 1 B V i l l n a v e C A S i n g e r R H S e n s i t i v e h i g h 一 r e s o l u t i o n c h r o ma t i n a n d c h r o mo s o me ma p p i n g i i n s i n e p r e s e n c e a n d o r i e n t a t i o n o f t w o c l o s e l y i n t e g r a t e d c o p i e s o f E B V i n a l y mp h o m a l i n e Ce l l 1 9 8 8 5 2 51 一 61 1 4 L a w r e n c e J B S i n g e r R H Mc N e l l J A I n t e r p h a s e a n d m e t a p h a s e r e s o l u t i o n o f d i f f e r e n t d i s t a n c e s w i t h i n t h e h u m a n d y s t r o p h i n g e n e S c i e n c e 1 9 9 0 2 4 9 9 2 8 一9 3 2 1 5 L i c h t e r P T a n g C J C e t a l Hi g h 一 r e s o l u t i o n ma p p i n g o f h u m a n c h r o mo s o m e 1 1 b y i i n s i t u h y b r i d i z a t i o n wi t h c o s mi d c l o n e s S c i e n c e 1 9 9 0 2 4 7 6 4一6 9 1 6 P a r r a I a n d Wi n d l e B H i g h r e s o l u t i o n v i s u a l ma p p i n g o f s t r e t c h e d DNA b y f l u o r e s c e n c e h y b r i d i z a t i o n Na t u r e Ge n e t i c s 1 9 9 3 5 1 7 2 1 1 7 R a m a n n a M S a n d P r a k k e n R S t r u c t u r e o f a n d h o m o l o g y b e t w e e n p a c h y t e n e a n d s o m a t i c m e t a p h a s e c h r omo s ome s o f t h e t oma t o Ge ne t i c a 1 9 6 7 3 8 1 1 5一 1 3 3 1 8 R i e d T B a l d i n i A e t a l S i m u l t a n e o u s v i s u a l i z a t i o n o f s e v e n d i f f e r e n t D NA p r o b e s b y i n s i t u h y b r i d i z a t i o n u s i n g c o mb i n a t o r i a l f l u o r e s c e n c e a n d d i g i t a l i ma g i n g mi c r o s c o p y P r o c Na i l Ac a d S c i US A 1 9 9 2 8 9 二1 3 8 8 1 3 9 2 1 9 S h e r ma n J D a n d S t a c k S M P h y s i c a l ma p o f c r o s s o v e r f r e q u e n c y o n s y n a p t o n e ma c o mp l e x e s f r o m t o ma t o p r i ma r y mi c r o s p o r o c y t e s T GC r e p o r t 1 9 9 5 4 5 4 2 一4 3 2 0 T r a s k B P i