氨基酸的薄层层析.doc

实验4 氨基酸的薄层层析一、实验原理薄层层析是一种将固定相在固体上铺成薄层进行层析的方法。由于该方法具有操作简便、层析展开时间短、灵敏度高、结果可视化等优点，已被广泛应用于生物化学、医药卫生、化学工业、农业生产和食品等领域，对天然化合物的分离和鉴定也已广泛应用。薄层层析时一般将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开。本实验应用硅胶作为固相支持物，用羧甲基纤维素钠作为粘合剂，以正丁醇、冰醋酸及水的混合液为展开剂，测定混合氨基酸中各分离斑点的Rf值（Rf值详见第一篇第三章第五节），以分离和鉴别混合氨基酸的成分。氨基酸的显色反应：茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸发生羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛，与此同时，还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成蓝色化合物而使氨基酸斑点显色。二、实验材料（一）样品1氨基酸标准溶液：（1）0.01mol/L丙氨酸：称取丙氨酸8.9mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。（2）0.01mol/L精氨酸：称取精氨酸17.4mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。（3）0.01mol/L甘氨酸：称取甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇溶液至10ml。2混合氨基酸溶液：将0.01mol/L丙氨酸、精氨酸、甘氨酸按等体积制成混合溶液。（二）试剂1硅胶G(C.P.) 20.5%羧甲基纤维素钠（CMCNa）：取羧甲基纤维素钠5g溶于1000ml蒸馏水中，煮沸，静置冷却，弃沉淀，取上清备用。3展开溶剂：按80:10:10比例（V/V）混合正丁醇、冰醋酸及蒸馏水，临用前配制。40.1%茚三酮溶液：取茚三酮（A.R.）0.1g溶于无水丙酮（A.R.）至100ml。5展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀展开剂和0.1%茚三酮溶液。（三）仪器及器材1层析板（615cm）；2小烧杯；3量筒（10mL）；4小尺子；5吹风机；6毛细玻璃管；7层析缸；8烘箱。三、实验步骤（一）实验流程点样显色制板层析 （二）操作步骤1制板（1）调浆：称取硅胶3g，加0.5%的羧甲基纤维素钠8ml，调成均匀的糊状。（2）涂布：取洁净的干燥玻璃板a均匀涂层b。 （3）干燥：将玻璃板水平放置，室温下放置0.5h，自然凉干。 （4）活化：70c烘干60分钟。a. 玻璃板要清洁平整，无油污。b. 粘在玻璃板侧面边上的硅胶粉应去掉，否则在层析时会有较强的边缘效应。c. 应逐步加温，温度过高易导致涂层裂开。2点样（1）标记：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点并做好标记。每个样品间相距1cm。（2）点样：用毛细管分别吸取丙氨酸、精氨酸、甘氨酸及混合氨基酸溶液，轻轻接触薄层表面点样。加样原点扩散直径不超过2mm。点样后用电吹风a轻轻吹干，必要时重复加样b。a. 用冷风吹干，避免破坏氨基酸。最好从玻板背面吹。b. 重复点样时必须等第一点样品干后再点第二点。3层析将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线a。盖好层析缸盖b，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线。a. 样点不能浸入到溶液中。b. 将层析缸盖涂上凡士林，防止层析液挥发。图9-8 薄层层析装置4显色用热风吹干或在90下烘干30min，即可显出各层斑点。（三）注意事项1吸附剂薄层层析用的吸附剂如氧化铝和硅胶的颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜，如果颗粒太大，展开时溶剂推进速度太快，分离效果不好。反之，颗粒太小，展开时太慢，斑点易拖尾，分离效果不好。2点样点样的次数依照样品溶液的浓度而定，样品量太少时，有的成分不易显示，样品量太多时易造成斑点过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离，点样后的斑点直径一般为0.2cm。3避免污染 整个层析过程中，避免用手接触层析板，必要时戴上手套。 四、结果与讨论（一）结果1层析结果：图9-9 氨基酸薄层层析结果图2数据记录按照下表记录各氨基酸色斑中心至样品原点中心距离（a）及溶剂前缘至样品原点中心距离（b）各斑点色斑中心至样品原点中心距离（a）溶剂前缘至样品原点中心距离（b）丙氨酸甘氨酸精氨酸混合点1混合点2混合点3平均a值溶剂前缘至样品原点中心距离（b）3结果计算与记录各斑点Rf值氨基酸名称丙氨酸甘氨酸