低分子肝素预处理对大鼠急性肺损伤的影响.doc

低分子肝素预处理对大鼠急性肺损伤的影响北京大学第一医院麻醉科邢军 吴新民【摘要】目的 探讨低分子肝素（LMWH）预处理对急性肺损伤（ALI）大鼠细胞因子和粘附分子表达的影响。方法 腹腔内注射内毒素制备ALI大鼠模型。50只SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、ALI组、LMWH预处理组（100u/kg、200u/kg和300u/kg），每组10只。观察肺湿干重比（W/D）、BALF中总蛋白浓度、肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性、肺组织TNF-水平、血浆凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血浆纤维蛋白原水平以及肺组织ICAM-1、E-selectin、组织因子（TF）和纤溶酶原激活物抑制物（PAI）-1 mRNA的表达情况。结果 ALI组的W/D、BALF总蛋白浓度、肺组织MPO活性和TNF-含量、肺组织炎性细胞因子、粘附分子的mRNA表达均明显升高（p0.05）；LMWH预处理后，肺组织MPO活性和TNF-含量明显降低（p0.05），但是BALF总蛋白浓度、肺组织ICAM-1和E-selectin的mRNA表达没有明显改变。ALI组和LMWH预处理三组的PT和APTT较盐水对照组有所升高（p0.05），而纤维蛋白原的水平显著降低（p0.05）；与ALI组相比，LMWH200组的PT时间明显降低（p0.05），纤维蛋白原的水平明显升高（p0.05）结论 LMWH预处理能抑制中性粒细胞激活，减低TNF-减轻ALI时的炎症反应。【关键词】 急性肺损伤；低分子肝素预处理；细胞因子；粘附分子；凝血与纤溶； The effects of low molecular weight heparin pretreatment on acute lung injury in ratsXing Jun, Wu Xin-min. Department of Aneshtesiology, First hospital, Peking University, Beijing 10034, China【Abstract】 Objective evaluate the effects of low molecular weight heparin (LMWH) pretreatment on preventing rats from acute lung injury induced by lipopolysaccharide (E. Coli O55:B5). Methods Fifty male SD rats were randomly divided into five groups (n=10). Control group, injected with saline intraperitoneally. Lipopolysaccharide (LPS) group, with intraperitoneal injection of LPS 6mg/kg body weight. LMWH 100 group, injected with LMWH 100u/kg subcutaneously 2 hours before LPS injection. LMWH 200 group, injected with LMWH 200u/kg subcutaneously 2 hours before LPS injection. LMWH 300 group, injected with LMWH 300u/kg subcutaneously 2 hours before LPS injection. Four hours after LPS/saline administration, the rats were anesthesized and killed. The lungs wet/dry ratio was determined. Total protein of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was calculated by BCA protein quantity method. MPO and caspase-3 activity of lung tissue were measured spectrophotometrically. The level of TNF- in lung tissue was quantitated by ELISA. Blood was withdrawed from the right ventricle of each rat. Plasmic prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT) and fibrinogen level was checked. The mRNA expressions of adhesion molecular (ICAM-1, E-selectin) and tissue factor (TF), plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in lung tissue were essayed by SYBR Green realtime RT-PCR. All animals lungs were partly resected and stained with HE for pathology. Results There was significantly difference in each index between LPS group and Control group(p0.05). Compared with LPS group, there was a markly decrease in lung wet/dry ratio, lung MPO activity, lung TNF- level and lung Caspase-3 activity in LMWH 100, 200 and 300 group(p0.05); in LMWH 200 group, the level of fibrinogen in plasma increased and lung PAI-1 mRNA expression decreased significantly (p0.05); No difference was detected in BALF total protein concentration between LMWH pretreatment group and LPS group. And LMWH pretreatment group didnt make apparent effects on lung ICAM-1 and E-selectin mRNA expression. Conclusion Injection of 6mg/kg LPS intraperitoneally can induce acute lung injury in rats. LMWH 100, 200 and 300 u/kg pretreatment didnt affect the expression of lung ICAM-1 and E-selectin, but they may decrease the lung MPO activity and TNF- level through improving the disturb of coagulation in ALI. The pretreatment of LMWH 200u/kg decreased the wasting of fibrinogen induced by ALI, but had no effect on prolonged coagularion.【Key words】 acute lung injury; pretreatment of LMWH; inflammatory mediator; adhesion molecular; coagulation and fibrinolysis; 急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是常见的威胁生命的急性呼吸衰竭。虽然肺保护性通气策略在一定程度上改善了死亡率，但是发病率和死亡率仍很高。为了寻找新的有效治疗方法，许多研究者开始研究凝血和纤溶在ALI/ARDS病程进展中的作用。ALI/ARDS病人常常需要机械通气和长期卧床，深静脉血栓的发生率很高，这时总需要应用LMWH来改善这种高凝状态。LMWH既有抗凝作用，又具有一定的抗炎效应，为此我们建立大鼠脂多糖致ALI模型，探讨LMWH预处理对ALI的影响。材料和方法动物选择与分组 成年SD大鼠50只（北京大学医学部动物实验中心提供），随机分为5组，盐水对照组（C组），急性肺损伤组（ALI组），LMWH100u/kg预处理组（LMWH100组），LMWH200u/kg预处理组（LMWH200组）和LMWH300u/kg预处理组（LMWH300组），每组10只。动物模型制备 术前不禁食水，用75%的乙醇消毒腹部，腹腔内注射LPS（Sigma公司）6mg/kg（用生理盐水稀释至2ml），制备大鼠ALI模型，4小时后用1%戊巴比妥钠5mg/kg麻醉，处死动物，采集标本。LMWH预处理组在ALI模型制备前2小时经皮下分别注射LMWH100u/kg、200u/kg和300u/kg，注射LPS后4小时处死动物。正常对照组腹腔内注射2ml生理盐水，4小时后采集标本。标本采集 处死动物后开胸，钳夹大鼠右侧四个肺叶，第一二个肺叶放于液氮中速冻后，保存于-70冰箱中，用于进行肺组织MPO活性和TNF-含量以及肺组织mRNA表达水平的测定；第三个肺叶用于肺湿干重比的测量；第四个肺叶保存于10%甲醛中，做病理学切片；用预冷的PBS缓冲液经右心室进行肺循环灌注直至左侧肺叶表面变白，切开气管置入14G套管针，结扎固定，用12ml预冷PBS缓冲液分4次进行支气管肺泡灌洗，收集每次的灌洗液（BALF），2000rpm离心5min，将上清保存于-20，用于BALF总蛋白浓度的测量。指标测定 （1）肺组织病理切片：用10%甲醛固定肺组织，脱水，透明，苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜（Olympus公司）下观察肺组织的病理学改变。（2）肺组织湿干重比（W/D）：取右肺第三肺叶，剔除多余结缔组织，拭干表面血液，用天平精确称量其重量（W），放入80烤箱烘烤48小时后，再次称量其重量（D），从而得到肺组织湿干重比（W/D）。（3）MPO试剂盒（南京建成生物公司）测定肺组织MPO活性：取适量肺组织准确称重，使用组织匀浆机（江苏其林医用仪器厂GF-1型）在冰上制备5%组织匀浆（“1”档，5秒/次3次）（匀浆缓冲液由试剂盒提供），按试剂盒说明依次加入试剂并孵育，使用紫外分光光度计（日本岛津公司UV2100型）在460nm处测量测定管和对照管的OD值。MPO活性（U/g）（测定管OD值对照管OD值）/11.3取样量（g）。（4）BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术公司）测量BALF中的总蛋白浓度：以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，进行梯度稀释（浓度范围0500g/ml），取20l样本和不同浓度标准品加到96孔板中指定孔中，向各孔加入200lBCA工作液（按50:1比例混合试剂A和试剂B配制而成），37孵育30min，测定各孔在620nm处（Biorad550型酶标仪）的OD值。在Excel软件中，根据标准品各浓度与OD值建立标准曲线（总蛋白浓度= 3907.6OD620773.33，R2=0.981），将样本OD值带入标准曲线方程，计算出样本的总蛋白浓度。（5）大鼠TNF- ELISA试剂盒（Bender MedSystems公司，Austria）测定肺组织TNF-水平：取适量肺组织（80-100mg），加入3ml匀浆缓冲液（）（0.5%Triton-X-100，150mM NaCl，15mM Tris，1mM CaCl2和1mM MgCl2，pH=7.4），使用组织匀浆机在冰上制备组织匀浆（“1”档，5秒/次3次），10000rpm离心15min（4），取上清测量TNF-的浓度（按说明书操作），在酶标仪上读取409nm的OD值。用BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术公司）测定上清液中总蛋白浓度，计算出每mg肺匀浆蛋白中TNF-的含量。(6) PT、APTT和血浆纤维蛋白原水平：实验大鼠麻醉后开胸，从右心室抽血2.7ml（注射器中预先加入0.109mol/L枸橼酸钠0.3ml）,上下颠倒4次混匀后静置15分钟，用ACL9000凝血功能分析仪测定血浆PT、APTT和纤维蛋白原水平。（7）SYBR Green实时定量RT-PCR测定肺组织ICAM-1、E-selectin、TF和PAI-1 mRNA的表达：Trizol法（Invitrogen公司）提取肺组织总RNA，用紫外分光光度计测量260nm和280nm处的OD值，计算出样本的纯度和RNA浓度。用无RNA酶DNA酶（Promega公司）去除RNA中可能含有的DNA污染，加入Oligo(dT)15引物（Promega公司）、M-MLV反转录酶（Promega公司）和dNTP（华美公司）等试剂合成cDNA，然后进行PCR反应。PCR引物设计和扩增片断大小见表一（由北京赛百盛公司合成）。PCR反应混合液（SYBR Green Realtime PCR Master Mix ）购自TOYOBO公司。25l PCR反应体系：灭菌注射用水9l，上下游引物混合液（5pmol/L）1l，PCR Master Mix12.5l，cDNA模板2.5l。反应条件：9560秒，9515秒6060秒（40个循环）。用2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，在紫外观测灯下观察并切下电泳条带，用玻璃奶回收纯化PCR产物，溶于TE缓冲液中，-20保存。在7300实时定量PCR仪（ABI公司，美国）上进行PCR反应：梯度（1:10）稀释标准品（1:101:106），并将其浓度记为106、105、104、103、102和10。取2.5l不同浓度标准品和样本cDNA加到PCR96孔板的指定孔中，继续加入反应体系中的其它反应物，按上述反应条件进行PCR反应。根据标准品的浓度和荧光读数建立标准曲线，计算出样本的浓度。以粘附分子和细胞因子与-actin浓度的比值作为表达水平的相对定量。将C组的比值记作1，计算其它各组mRNA的表达相对于C组增加的倍数。表1 PCR引物序列引物序列 5 to 3扩增片断大小（bp）Beta-actinF: 5-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3R: 5-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3101ICAM-1F: 5-AGCTCTTCAAGCTGAGCGACAT-3R: 5-ACTCACTCTGGGAACGAATACA-3118E-selectinF: 5-CACGGTGAATGCGTTGAGAC-3R: 5-GGCTTCCATGGTCAGGGTATT-3121TFF: 5-TTGTGGGAGCAGTGGTGTTC-3R: 5-GCGTCAGCCTCCTCGTCTAT-3138PAI-1F: 5-TGGAGAGGCACACCAAAGGTAT-3R: -CCTCTAAGAAGGGGGTCTTCCA-3126统计学处理: 数据以均数标准差(x s) 表示, 用SPSS 11.0 统计分析软件对数据进行处理, 组间比较采用单因素方差分析和q 检验, P 0.05 为差异有统计学意义。结果肺组织病理切片检查：C组肺组织结构清晰、肺泡壁完整，肺间质和肺泡腔无渗出（图1）。ALI组肺组织结构紊乱，肺间质明显充血水肿，肺泡腔塌陷（图2）。三个LMWH预处理组中，LMWH100组可以看到间质的充血水肿明显减轻（图3），而LMWH200组（图4）和LMWH300（图5）并未观察到明显的病理改变。肺湿干重比和BALF总蛋白浓度的变化：与C组比较，ALI组这两个指标均显著增加（p0.05）。LMWH200和LMWH300组的肺湿干重比与ALI组的差异有统计意义（p0.05）（见表2）。肺组织MPO活性、肺组织TNF-含量的变化：ALI组的肺组织MPO活性和TNF-含量较C组显著增加（p0.05）。LMWH100、200和300组的肺组织MPO活性与ALI组间的差异有统计学意义（p0.001）；肺组织TNF-水平也降低了，其中LMWH200组与ALI组间有统计学差异（p0.05）（见表2）。ALI组和LMWH预处理三组的PT和APTT较盐水对照组有所升高（p0.05），而纤维蛋白原的水平显著降低（p0.05）；与ALI组相比，LMWH200组的PT时间明显降低（p0.05），纤维蛋白原的水平明显升高（p0.05）（见表3）。ALI组肺组织ICAM-1和E-selectin的表达比C组明显增加（p0.05）。LMWM各组降低了LPS致肺损伤后的TNF-的表达（p0.05），LMWH各组的粘附分子表达与ALI组比较差异没有统计学意义。ALI组TF和PAI-1的mRNA表达较盐水对照组显著升高（p0.05）；LMWH预处理三组TF的mRNA表达较盐水对照组显著升高（p0.05）；LMWH200组和300组的 PAI-1 mRNA表达较ALI组明显降低（p0.05）（见表4）。表2 肺湿干重比、BALF总蛋白浓度、肺组织MPO活性和TNF-含量的变化(n=10 s）组别肺组织湿干重比BALF总蛋白浓度（g/ml）肺组织MPO（U/g组织湿片）肺组织TNF-（pg/mg）C组4.860.13264.14120.9951.5331.8163.4528.59ALI组6.221.09* 477.10101.08*119.7664.60*123.0964.27*LMWH100组5.770.77435.68207.9866.0528.44# #81.1751.99LMWH200组5.170.44#475.93231.94*57.3110.33# #74.9842.30#LMWH300组5.390.63#433.73259.3261.3712.28# #80.9028.39与C组相比，*p0.05，*p0.001与ALI组相比，#p0.05，# #p0.05表3 血浆PT、APTT和纤维蛋白原水平测定（n=9 s）组别PT（秒）APTT（秒）纤维蛋白原（g/L）C组17.571.7415.662.831.630.06ALI组21.961.87*25.506.08*1.070.32*LMWH100组21.862.12*26.477.28*1.290.39*LMWH200组19.791.36* #23.684.42*1.360.19* #LMWH300组21.761.05*29.505.34*1.080.23*与对照组比较，*P0.05，*P0.01；与脂多糖组比较，#P0.05，#P0.01；表4 肺组织炎性细胞因子和粘附分子mRNA的表达（x s）组别ICAM-1E-selectinTF（倍数）PAI-1（倍数）C组1.000.251.000.791.00000.54791.00000.4380ALI组2.230.90*6.245.95*3.56271.5021*53.34629.6905*LMWH100组1.840.36*3.001.22*5.35543.3624*54.644019.0033*LMWH200组2.240.63*5.315.48*4.91041.4071*34.34938.0510* #LMWH300组1.750.66*3.151.81*4.01211.6189*36.672510.3349* #与C组相比，*p0.05，*p0.001与ALI组相比，#p0.05，# #p0.001 图1 C组 图2 ALI组 图3 LMWH100组 图4 LMWH200组图5 LMWH300组讨 论低分子量肝素（low molecular weight heparin , LMWH）是近二十年发展起来的新一代肝素类抗血栓药物，它是由普通肝素（unfractionated heparin，UFH）经化学或酶解聚的方法得到的相对低分子质量的肝素片段或经分级法得到的低分子量肝素组分，分子量范围一般为30008000D，平均分子量为5000D左右。LMWH有抗凝血、抗血栓、调血脂、抗肿瘤等作用。与普通肝素相比，LMWH具有皮下注射吸收好，半衰期长，生物利用度高，与血浆、血小板亲和力小，出血副作用少等优点。LMWH的主要药理作用为抗凝和抗血栓作用（1、2）。肝素的抗凝作用一般认为主要通过两个方面：（1）对凝血酶的抑制作用；（2）对凝血活性因子Xa ( FXa) 的抑制作用。LMWH的作用机制与肝素一样都是依赖于戊糖结构与抗凝血酶- (AT-)的结合，从而增强AT-对Xa因子和凝血酶的抑制作用。其中肝素抑制凝血酶的作用不但要求肝素与 AT- 的结合，还同时要求肝素与凝血酶的直接结合。这就需要肝素分子有足够的长度（至少18个单糖的长度，分子量至少为5400D），但肝素增强AT-抑制Xa因子的作用不需要肝素与Xa因子直接接触，此种作用对肝素无最低分子量上的要求。LMWH由于片断较短，大部分分子长度均低于18个单糖的长度，因此抗Xa因子作用明显强于肝素。研究表明普通肝素抗Xa因子与抗凝血酶的活性之比约为1，而LMWH 抗Xa因子与抗凝血酶的活性之比介于24 之间。凝血酶的激活是血栓形成的主要因素之一，LMWH由于相对分子质量小有很强的抗Xa因子作用，能抑制凝血酶的激活，还能抑制血小板聚集，减少暂时性血小板凝块转变为永久性血小板纤维蛋白凝块的发生几率，能改变血液流变性，降低血液粘度，维持血液正常流动，因而抗血栓形成作用更加明显。研究发现，LMWH还具有许多其他的作用，例如：抑制肿瘤生长和转移的作用（3、4）、抑制肾小球系膜细胞及基质增生（5、6）以及调节血脂代谢、保护心肝肾组织细胞不受高胆固醇血症的损害（7）等作用。此外，LMWH还具有抗炎作用。近年来许多研究和实验观察到凝血与炎症存在相互作用的网络关系，一些天然抗凝物质具有抗炎作用。最初发现抗凝剂具有抗炎作用也是源于治疗炎症反应的凝血紊乱。有多项动物实验发现LMWH具有抗炎作用，其可能的抗炎机制包括：(1)抑制血管内皮细胞上ICAM-1和E-selectin的表达，降低中性粒细胞与内皮细胞的粘附（8）。(2)通过电荷依赖性机制防止血小板、红细胞粘附、聚集; 结合并灭活对血管有损伤作用的活性物质以保护内皮细胞并促进损伤的内皮细胞修复和生长（9）。(3) 抗自由基损伤作用。肝素能抑制被激活的PMN 呼吸爆发, 并能阻止PMN 的粘附, 避免PMN释放自由基和溶酶体酶（10）。(4)降低炎性细胞因子的表达，从而减轻炎症反应（11）。LMWH还有抗过敏、抗补体、增强网状内皮系统吞噬细胞活性、直接抗内毒素等作用。在对类风湿性关节炎、支气管哮喘和炎性肠病的临床研究（12-14）中，LMWH也显示减轻炎症反应的特性。ALI是由感染等多因素引起的、以中性粒细胞浸润为主的肺组织炎症反应, 伴有TNF-和IL-1等细胞因子以及细胞间粘附分子(ICAM)、血管内皮粘附分子(VCAM)和E选择素等粘附分子的过度表达（15）。多种炎性介质的产生和肺组织的广泛损害可引起急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功能障碍综合征(MODS)。同时，内毒素、TNF-和IL-1能刺激单核细胞和内皮细胞大量表达组织因子( TF), 激活外源性凝血途径，产生大量具有促凝作用的凝血酶。另一方面，内源性抗凝物质蛋白C(PC) 和AT- 水平显著下降，影响了抗凝系统的作用； TNF-等细胞因子还导致纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)大量产生，造成纤溶抑制。既然LMWH本身兼具抗凝和抗炎两大特性，那么在炎症发生初始或在某些高危易感病人中预防性使用能否减轻炎症反应呢？因此我们采用皮下注射LMWH和腹腔内注射LPS的方式模拟LMWH在临床的使用情况和腹腔内感染致急性肺损伤的模型，并对肺通透性、中性粒细胞激活、炎症介质的水平、粘附分子的表达以及凝血和纤溶等方面进行了测定。急性肺损伤时，激活的中性粒细胞在肺血管处聚集，浸润并迁移至肺间质和肺泡腔，释放促炎性细胞因子和氧自由基，破坏血管内皮和肺泡上皮的完整性，肺血管通透性增加（16-18。中性粒细胞在ALI时的炎症反应中有着重要的作用。因此，人们常用中性粒细胞激活的强度来代表肺损伤的严重程度。髓过氧化物酶（MPO）主要位于中性粒细胞的胞浆中，在单核细胞和巨噬细胞中含量极低（19、20）PO活性的高低在很大范围内与中性粒细胞的数量成正比，并且检测方法简易可靠，现在已经被广泛用于评估中性粒细胞聚集并激活的程度。Sjoukje H等（21人对小鼠DIC模型的研究中发现LMWH对肺组织MPO活性并没有降低的作用。Darien等人在进行LMWH对猪急性肺损伤影响的实验中显示，给予LMWH能缓解脂多糖介导的TNF-增加，减轻肺动脉高压以及中性粒细胞迁移和肺水肿。本实验采用比色法测量了肺组织MPO活性，用来量化评估中性粒细胞在肺部聚集的多少。注射脂多糖4小时后，肺组织的MPO活性明显高于盐水对照组，而在给予LMWH预处理后MPO活性明显降低了（p0.05）。这说明LMWH能抑制中性粒细胞在肺部的聚集。越来越多的证据表明，粘附分子参与并介导了细胞及细胞与基质的相互作用，在炎症的发生过程中起着重要作用。中性粒细胞与血管内皮细胞的结合并渗出是一个多重的过程，而粘附分子在此过程中发挥着不可替代的作用。有关粘附分子在ALI/ARDS中的作用，众多学者也进行了大量的研究。Sakamaki F等分别对19例ALI患者、29例患有其他肺部疾病如特发性肺纤维化、肺炎等的患者及正常人的血浆可溶性P-选择素（PPS）的浓度做了测定，结果发现ALI组患者的PPS浓度明显高于非ALI组，也高于正常对照组，二者之间有显著性差异（p0.05）。动物实验证实P-选择素单克隆抗体可抑制髓过氧化物酶（MPO）的活性，减轻肺出血，改善肺气体交换功能。Samer K等（22则报道ALI病人血浆中可溶性E-选择素、ICAM-1和量比健康志愿者显著升高，L-选择素含量大大下降，他们认为血浆中可溶性粘附分子可作为ALI病情监测的标志物。目前，观察LMWH对炎症反应时粘附分子表达的影响大多在内皮细胞与单核细胞共同培养的离体实验中进行研究。例如Manduteanu I等人的研究发现，依诺肝素(血浆浓度16mg/ml)对人脐静脉内皮细胞预处理后，能抑制脂多糖诱导的E-selectin表达和TNF-刺激引起的ICAM-1的表达，从而降低单核细胞与内皮细胞的粘附（23）。Lever等人观察到血浆浓度50-1000u/ml的LMWH能明显抑制中性粒细胞与激活的人脐静脉内皮细胞之间的粘附，但对粘附分子ICAM-1和E-selectin的表达影响很小（34）。而在另一个单核细胞与内皮细胞的离体研究中，LMWH并没有显示出对E-selectin表达的影响（21）。为了探讨LMWH在活体ALI动物中的影响，本实验采用实时定量PCR的方法，测量肺组织ICAM-1和E-selectin的mRNA水平。这样便于在分析LMWH在正常使用剂量时产生的效应。研究表明（22），发生ALI/ARDS4小时后，病人血中可溶性粘附分子才开始升高，大约在24小时达到高峰。本实验拟定在注射脂多糖4小时时采集标本，因此并没有选择检测循环中可溶性粘附分子，而是采用实时定量RT-PCR的方法测定肺组织粘附分子mRNA的表达。我们知道，mRNA表达水平的改变会先于蛋白水平的改变。因此，我们希望通过这个方法确定LMWH对粘附分子表达有无影响。实验结果显示，LMWH预处理组的ICAM-1和E-selectin的mRNA表达较脂多糖组差异没有统计学意义。这与Manduteanu I等人在离体研究（23）中得到的结论有所不同。原因可能有以下几点： Manduteanu I等人使用的依诺肝素的剂量很大，达到了血浆浓度16mg/ml，而这么大的剂量在活体动物身上是不适用的。离体实验的内环境比较单一，影响因素少，而活体动物实验时内环境复杂，影响因素较多。从我们的实验结果来看，LMWH降低急性肺损伤时肺组织炎症反应的机制可能与降低粘附分子的表达无关。LMWH作为一种抗凝抗血栓的药物，由于其安全性高于普通肝素，因此在临床上预防血栓形成时，通常很少进行特殊监测。但是在某些危重疾病时，如急性肺损伤时，除了呼吸功能不全之外，常伴随着包括凝血系统紊乱在内的多个系统受累，病情非常复杂，在应用抗凝药物时常常会顾虑会有出血倾向，需进行密切的观察和对凝血功能进行监测。此外，选用合适的剂量也能减少出血等不良反应。以往关于LMWH对急性肺损伤影响的研究所选用的LMWH剂量范围很大，有静脉给予5IU抗a因子的弗希肝素（Fraxiparin）、给急性肺损伤大鼠皮下注射LMWH1000IU/kg以及静脉注射亭扎肝素钠（Tinzaparin）10mg/kg等，均未发生出血等不良反应。依诺肝素每1mg含100单位抗a因子，治疗深静脉血栓的剂量为1mg/kg（即100抗a /kg），高度血栓形成危险病人预防用药的剂量为40mg qd；中度血栓形成危险病人为20mg qd。在治疗弥散性血管内凝血时，低分子量肝素的剂量为75-150抗a/kg/d。动物与人类凝血系统的状态是不同的。由于长期以来形成的自我保护机制，动物的凝血系统通常处于高凝状态，以便在自然环境中受伤后能够迅速止血。因此，本实验选用的依诺肝素的剂量比治疗人凝血紊乱时的剂量要大。为了明确LMWH对急性肺损伤时凝血系统的影响，本实验测量了右心室血的PT、APTT和纤维蛋白原水平以及肺组织TF和PAI-1 mRNA的表达水平。结果显示，脂多糖组的PT和APTT值较盐水对照组明显延长（p0.05），血浆纤维蛋白原水平明显降低（p0.001）。这说明在给予脂多糖4个小时后已经处于低凝状态了。我们的预实验显示， 在给予脂多糖后1、2和3小时时测定右室血PT、APTT和纤维蛋白原水平，PT和APTT的值均较盐水对照组延长，血浆纤维蛋白原水平均降低。因此，从全身凝血状态上来说，从注射脂多糖起就开始向低凝方向发展了。文献上所说的脂多糖引起的高凝状态和纤溶抑制应该发生于受累脏器的微循环中，类似于DIC病生理过程中的微循环障碍。在我们给予LMWH预处理后，LMWH200u/kg组的PT值较脂多糖组明显降低（p0.05），APTT值也有所降低，但与脂多糖组相比差异没有统计学意义。LMWH100u/kg组和300u/kg组的PT和APTT值与脂多糖组相比无明显差异。在血浆纤维蛋白原水平方面，LMWH200u/kg预处理组能明显升高纤维蛋白原水平（p0.05），减少纤维蛋白原的消耗。从我们的实验结果大概可以看出，过高或过低的LMWH剂量均不能改善ALI时的凝血紊乱，需要选择适宜的剂量。在本实验中，LMWH300u/kg组的大鼠有2只发生了眼球结膜出血。组织因子(TF)是位于细胞表面可溶性的糖蛋白，是外源性凝血通路的启动因子。组织因子除凝血作用外尚具有促进炎症反应的作用。TF强烈的促炎症反应主要由单核细胞及其释放的化学增活素介导，需要VIIa因子诱导的钙外流参与。TF可增加白细胞粘附及从内皮细胞渗出，促进氧自由基产生、纤维蛋白原形成、组织相容性复合物和细胞粘附分子的表达(25)。TNF-和IL-1使内皮细胞组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator, tPA)的合成减少，却增加了组织型纤溶酶原激活物抑制剂(tissue plasminogen activaor inhibitor , tPAI)的合成，这些机能紊乱的最终结果是纤溶酶的生成减少及活性降低。脂多糖组TF和PAI-1的表达明显高于盐水对照组（p0.05），三个LMWH预处理组的TF表达较脂多糖组没有降低，但LMWH200组和300组的PAI-1的表达与脂多糖组相比明显降低（p0.05）。结合血浆纤维蛋白原的实验结果来看，LMWH预处理对纤溶系统的改善更为明显。本实验给予LMWH时间是在ALI发生以前，而在许多临床情况中，通常是在ALI发生以后才给予LMWH，那么这时LMWH会产生什么影响呢？另外，鉴于动物与人在各个方面还存在着差异，在动物实验中得到的结论也不能完全简单地应用于临床实验或临床病人的治疗，还需对LMWH改善急性肺损伤的机理和临床剂量的选择进行更多的研究，以便更好地为ALI的临床治疗提供理论依据。我们可以对临床上使用LMWH预防深静脉血栓的手术病人和因需呼吸机支持、长期卧床导致体内高凝而需LMWH治疗的病人进行回顾性研究，观察LMWH的应用对炎症因子等方面的影响，这样就可以知道在正常临床剂量时LMWH能否产生抗炎作用。从本实验的结果来看，LMWH200u/kg预处理能更明显地减轻大鼠急性肺损伤时中性粒细胞在肺部激活，降低TNF-的水平，改善肺血管的通透性，从而减轻急性肺损伤。同时，这个LMWH剂量也能有效的改善ALI时的纤溶系统的紊乱，降低纤维蛋白原的消耗。结 论6mg/kg的脂多糖腹腔内注射可以导致大鼠急性肺损伤，同时在给予4小时后导致低凝状态。LMWH100、200和300u/kg预处理没有影响肺组织粘附分子的表达，但能减少中性粒细胞在肺部聚集，降低肺组织TNF-含量。LMWH200u/kg预处理改善了纤溶系统的紊乱，减轻了急性肺损伤诱发的纤维蛋白原的消耗，但是对低凝血状态无明显影响。参考文献1. 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