微卫星DNA.doc

昆虫分类学课程论文微卫星DNA在种下分化及近缘种的鉴定中的应用农业昆虫与害虫防治 姚远 M071105摘要：微卫星DNA标记作为一种多态性和稳定性高、重复性好、呈共显性的分子遗传标记技术，目前已被广泛应用于昆虫学的研究中。本文介绍了微卫星DNA标记的基本原理和特点，并综述了近年来该技术在昆虫种群遗传结构及分化、近缘种的鉴定、遗传图谱的构建、基因定位以及系统发生等领域中的应用。关键词: 微卫星DNA标记；多态性；分化；种群早在1974 年，Skinger在蟹的DNA 中发现了一类短串联重复序列TAGG。随后人们在人、动物和酵母的基因组中都发现了大量的简单重复序列，因为其比小卫星(1025bp)短，每个重复单位仅16bp，重复数1020次，是头尾相连的串联重复序列，故称微卫星(microsatellite)，又称为简单序列重复DNA(Simple Sequence Repeat，SSR)。重复类型有两种单核苷酸如A/T、C/G；四种二核苷酸重复AT/TA、AC/TG、AG/TC、CG/GC 以及三、四核苷酸重复类型等，但研究发现较多的为AC/TG，约占57%，其它类型较少。而且根据微卫星核心序列排列方式的不同，可分为完全(perfect)，不完全(imperfect)和复合型(compound)微卫星。20世纪七八十年代以来，伴随着分子生物学的飞速发展，出现了多种多样的DNA分子标记1。目前常用的DNA分子标记技术有限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism，RFLP) 、数量可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat， VNTR) 、随机扩增多态性DNA ( random amp lified polymorphic DNA， RAPD) 、扩增片段长度多态性( amp lified fragment length polymorphism， AFLP) 、微卫星标记(microsatellite marker) 、简单重复序列间扩增( inter-simple sequence repeat， ISSR)和单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphysm， SNP) 。微卫星标记与其他分子标记相比，具有多态性和杂合度高、稳定性和重复性好、在不同种群中分布广、呈孟德尔共显性遗传等优点2 ，正日益受到昆虫学家们的重视，在昆虫学研究中扮演着日益重要的角色。1 微卫星DNA的结构和功能微卫星DNA也称简单重复序列，由Miesfeld et al3于1981年首先从人类基因文库中发现。其核心结构是由2 - 10个核苷酸为重复单位串联组成的长达几十个核苷酸的序列，它在真核生物的基因组中广泛存在，并且具有较高的多态性4 。按照重复结构的不同，微卫星DNA可分为3种基本类型5 : (1)完全重复型，如(CA) n; (2)不完全重复型，如(CA) n. CCA. (CA)m; (3)复合型，如(CA) n ( TG)m。微卫星DNA在真核生物基因组中的分布比较均匀，平均每10 kb DNA序列中出现1个微卫星序列5-6 。同时，微卫星DNA既可存在于基因组的非编码区中，也可存在于基因组的编码区中 20-22 。其具体功能还不是完全清楚，目前一般认为它可能参与基因调控、影响基因的转录和翻译等过程，从而影响蛋白质的编码和功能，它的积累最终会导致表型的改变7 。此外，微卫星DNA还有可能参与染色体折叠，维持染色体结构，参与端粒和着丝粒形成，并且在细胞周期调控和错配修复等方面起到一定的作用8 。而对于其来源，目前认为微卫星丰富的多态性的产生可能与DNA重组过程中的不等价交换有关，也可能与DNA复制过程中的“滑链错配”( slipped-strand mispairing)有关9 。从进化角度看，物种间重复序列并不是以前一些人所认为的“垃圾”序列，其差异是自然选择的结果，在生物进化过程中起着重要的调节作用。进化层次越高的生物，重复序列占总DNA的比重越大。如重复序列占噬菌体基因组的10% ，细菌基因组的20% ，酵母基因组的30% ，线虫基因组的60% ，在人的基因组中这一指数则高达90%9-10 。2 微卫星标记技术概况微卫星(Microsatellites) ，又称简单序列重复(Simple sequence repeats ，SSRs) 、短串联重复( Short tandem repeats ，STRs) 、简单序列长度多态性(Simple sequence length polymorphism ，SSLP) ，是指以少数几个核苷酸(一般为16个) 为重复单位组成的简单的串联重复序列，由于重复的次数不同以及重复的程度不一致而造成这些序列的多态性。微卫星上不同长度的等位基因按简单的孟德尔方式遗传。由于微卫星具有高度多态性、在基因组中含量丰富且分布均匀等优点，这一技术很快便发展为一种分子标记，并在自然种群的许多研究中得到了广泛应用。2.1微卫星标记的基本原理SSR标记由核心序列和两翼的保守序列组成，根据两侧保守的DNA 序列设计出互补的特定寡核苷酸引物，然后对基因组DNA 进行PCR 扩增，利用琼脂糖凝胶电泳或高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行分离，从而检测出DNA 的多态性，即检测出了不同个体在每个微卫星座位上的差别31 - 32 。2.2引物的筛选根据微卫星两侧翼的保守序列可设计出一段互补序列的寡聚核苷酸引物。以往的方法是先构建DNA文库，然后筛选出重复性好、具有多态性的微卫星位点，但这种方法工作量大，成本高，目前只用于模式生物的研究11 。近年来，随着基因组计划的开展和大规模测序工作的进行，互联网上一些公共数据库(如GenBank、EMBL)中的DNA序列和EST序列越来越多，可以方便地查找到相关的目标序列来设计相应SSR引物，也可根据已发表的文献上相关物种的已知引物来设计目标引物 16，34 - 35 。2.3 微卫星的PCR扩增进行SSR分析时，首先从生物样本中提取基因组DNA，并保证其具备一定的浓度和纯度。在随后的PCR扩增程序中，需针对不同引物和不同物种基因组DNA来优化扩增条件，即通过预实验对体系中各成分浓度、退火温度、循环次数和时间等反应参数进行调整优化，以获得清晰、重复性好的谱带。PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。2.4 微卫星标记的特点微卫星标记具有以下特点。(1)微卫星DNA在真核生物中广泛存在。(2)通常呈孟德尔式遗传，具有很好的稳定性、多态性和杂合度，并且等位基因间呈共显性遗传特点3 4，8，10 - 12 。(3)DNA用量少，并且可以利用非损伤取样，如从唾液、毛发、排泄物、珍贵标本以及化石材料中取样进行种群遗传结构的研究13 。(4)从一个物种中获得的微卫星引物在近缘种中具有一定的通用性，随着现在大量序列数据的出现，使设计未知物种的微卫星引物越来越方便。(5)微卫星DNA较容易扩增，且PCR产物通过电泳可检测到单碱基的差异，遗传信息量大。(6)微卫星DNA检测容易，适合进行自动化分析，省时省力。3 微卫星标记在昆虫学研究中的应用3.1 群体遗传结构的分析微卫星的突变速率在不同物种、同一物种的不同位点甚至在同一位点的不同等位基因间都存在着较大的差异14-15 ，因此，微卫星具有高度的遗传多态性。通过分析微卫星多态位点的比率及杂合度，可了解昆虫种群的遗传多样性，从而进一步分析昆虫的群体遗传结构16 。England et al7应用8个微卫星位点研究了黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)的种群结构，发现相对于异型酶来说，微卫星具有更高的多态性。杨效文等17通过构建棉蚜(Aphis gossypii)基因组DNA 300 - 800 bp的插入文库，筛选出2个微卫星位点，并对棉蚜的种群分化做了深入研究。Kamau et al18利用微卫星位点多态性研究冈比亚按蚊(Anopheles gam biae) ，发现地理上的隔离使得不同地区的种群由于缺乏基因交流，而导致种群分化。Estoupet al19利用微卫星DNA的多态性研究西方蜜蜂(Apis mellifera)群体遗传结构， 结果表明，在7个微卫星位点上，7个亚种的9个群体间存在较大差异，在平均杂合度和等位基因的数目上，非洲蜜蜂显著高于欧洲蜜蜂亚种。Evans20利用微卫星标记分析了Myrmica tahoensis种群的遗传关系，发现同时产生雄性和雌性后代的群体中，个体间亲缘关系较远;主要产生雌性后代的群体中，则由亲缘关系极近的雌性(工蚁和蚁后)组成。Segura21对哥斯达黎加的非洲化蜜蜂进行了微卫星DNA分析，结果显示，在该群体内具有较高的等位基因和单倍体频率，群体内存在着丰富的遗传多样性。Reddy et al22进行了家蚕基因组SSR标记的相关研究，利用15个SSR标记对家蚕13个品系进行了多态性分析，鉴定了滞育和非滞育品系特有的SSR标记。龚鹏等48利用微卫星标记方法，对棉蚜的DNA多态性进行分析，明确了不同蚜型之间的遗传关系。Kim et al23利用微卫星标记分析了美国9个州10个地区595个玉米根虫(Diabrotica virgifera)的遗传多样性，明确其种群的遗传结构。由于微卫星标记是共显性标记， 许多等位基因表现出高度的杂合性，并且遵循孟德尔式遗法则，利用微卫星标记来研究昆虫种群间和种群内的遗传特性，可以得到丰富的遗传多样性信息。3. 2昆虫行为和习性的研究微卫星标记具有多态性高、信息量大等特点，因而国内外利用该技术对营社会性生活的昆虫的行为和习性也进行了大量研究24 。微卫星技术主要用于昆虫繁殖和交配特性的研究。Trontti et al25利用微卫星标记研究了斜结蚁( Plagiolepis pygm aea) 3个种群的交配行为和分布模式。Kraaijeveld et al26利用微卫星分析地中海野生雌性果蝇(Ceratitis capitata)的后代，研究表明，在繁殖季节，雌性果蝇交尾频率高是普遍现象，该结果为利用不育技术防治害虫奠定了一定的理论基础。Maki2Petays et al27采用12个微卫星位点研究蚂蚁Form ica aquilonia和Formica lugubris种群数量与栖息地面积的关系，结果表明，森林覆盖率的下降导致这两种蚂蚁种群的衰落和重新分布，栖息地的缩小已经威胁到其种群行为活力和生存能力。Ansell et al28通过扩增和比对从蚊虫和其相应宿主血液中提取的基因组DNA的微卫星序列，不仅为蚊虫的宿主选择性研究提供依据，而且也为个体患蚊媒病的风险评估提供了依据。3.3遗传图谱的构建自1987年Doniskeller et al29构建人类第1张RFLP连锁图以来，分子标记技术越来越多地应用于其他物种遗传图谱的构建。建立高密度遗传连锁图谱的关键是有多态性丰富的遗传标记。形态标记、细胞学标记和生化标记等传统的遗传标记方法，存在着多态性和分辨率低、图距大等缺点，而微卫星标记能弥补传统标记的许多缺陷，因而成为构建遗传连锁图谱的有效工具，现已广泛应用于遗传作图。Lanzaro et al30应用微卫星的多态性绘制了冈比亚按蚊(Anopheles gam biae)的基因图谱，发现相对于同工酶，微卫星具有更高的多态性。Zheng et al59分别用46、57和28个微卫星DNA作为分子遗传标记，构建了冈比亚按蚊X染色体、2号染色体和3号染色体的精密遗传连锁图谱。Gadau et al30-31构建了包含6个微卫星和73个RAPD 标记的熊蜂(Bom bus terrestris)的遗传连锁图谱，将它们定位在21个连锁群内，共计935. 1 cM，并利用隔离分析法定位了熊蜂性别决定基因的位点。Li et al32利用微卫星标记构建了31个不同起源的家蚕品系(Bom byxmori)的指纹图谱，表明SSR 标记可作为序列示踪位点( sequence tagged site，STS) ，结合已经构建的家蚕RFLP等高密度连锁图谱，可快速、经济、有效地构建出整个家蚕基因组图谱。微卫星标记对样本基因组DNA的用量较少，非常适用于研究基因组DNA含量相对较少的昆虫。采用微卫星标记技术构建饱和的昆虫微卫星图谱，不仅为害虫控制和益虫保护提供了有效的途径，而且在昆虫(如果蝇、家蚕等)全基因组测序以及遗传图谱的构建中发挥重要的作用。3.4 特定基因的定位从1911年发现果蝇染色体上的5个基因图以来，昆虫遗传学家越来越重视把某个特定基因定位在某条染色体上的研究32 。微卫星DNA 序列具有高度保守性和专一性，可使其特异地定位于染色体的某一位置。Gorman et al12采用微卫星标记技术定位并克隆了冈比亚按蚊黑化包被疟原虫相关基因，该结果可用于解释44%的黑化表型。Zheng et al11在冈比亚按蚊染色体上发现了3个与吞噬疟原虫有关的数量性状基因座位(quantitative trait loci ,QTL) ，其中一个为主效QTL，另两个则为微效QTL。Bosio et al14也利用QTL定位，成功地在一个杂合子染色体上，将影响登革热病毒对埃及伊蚊(Aedes aegypti)感染能力的QTL进行了定位。采用微卫星标记技术可以更加有效地寻找和克隆有用的目的基因，从而在分子水平上为害虫的防治、益虫的保护提供理论基础。3.5物种的进化与系统发生基因组DNA的改变是物种进化的本质，微卫星的突变速率较快，因而表现出丰富的遗传多态性 10，20-21 。微卫星DNA 的多态性能够反映物种的进化历史，而共有的等位基因在该物种的基因组中最为保守。因此，微卫星DNA标记被普遍认为是遗传信息含量较高、分辨力较好的遗传标记。Estoup et al5利用微卫星标记分析蜂群内个体间的亲缘关系，估计与蜂王交配的雄蜂的个数，确定了西方蜜蜂是由3个亲缘较远的祖先进化而来。Franck et al33利用微卫星技术研究西方蜜蜂欧洲亚种的起源，并利用8个多态性微卫星位点检测近东地区蜜蜂的DNA数据，证实近东地区蜜蜂是西方蜜蜂的第4个分支。Sunnucks et al34用微卫星标记技术检测了澳大利亚麦长管蚜(Sitobion miscanth i)的基因组DNA，并阐明了其周期性孤雌生殖和寄主专化之间的遗传关系。Wilson et al25利用SSR标记研究荻草谷网蚜属的Sitobion m iscanthi和Sitobion fagariae的生活史，并从进化的角度解释了蚜虫在不同地理的种群具有不同的生殖方式。微卫星标记技术使研究人员在DNA水平上更精确、有效地分析物种的进化速率、遗传距离以及其进化与演变过程成为可能，利用微卫星标记技术可以绘制出比其他分子遗传学标记更为精确的系统进化树。4 问题与展望当今，对生物学的研究已经进入了分子水平，微卫星标记可从基因水平上揭示物种的起源、进化、系统发生以及行为习性等，使人类对物种起源和进化的认识更具客观性。但该技术在运用过程中也受到一些因素的制约。首先，种群中非同源相似等位基因的普遍存在，给种群遗传多态性的评估带来误差31 。其次，微卫星标记的筛选过程繁杂，筛选出一个理想的微卫星标记通常需花26个月的时间，每个位点大约花费1500美元35。而且一些物种微卫星DNA引物筛选非常困难，如鳞翅目昆虫18 。第三，以PCR为基础的微卫星分子标记技术，其检测和应用不仅受PCR扩增结果的限制，而且还需要高分辨率的检测方法(如PAGE银染) ，这些都使微卫星的应用受到一定限制。尽管如此，微卫星DNA技术作为一项新的分子遗传标记技术，以其相对于其他标记技术的各种优势，在当今昆虫学研究中扮演着重要角色，在昆虫群体遗传结构变化、遗传图谱的构建、基因定位、系统发育关系的分析、昆虫习性和行为的探索等方面的研究中起着重要的作用，为害虫防治和益虫保护提供了新的研究角度和理论基础。随着微卫星标记技术研究的不断深入，实验手段和技术日趋完善，结合各种先进的统计分析方法，必将在昆虫学各领域的研究中得到更广泛应用。参考文献 1 龚鹏,杨效文,谭声江,等.分子遗传标记技术及其在昆虫科学中的应用 J .昆虫知识, 2001, 38 (2) : 86 - 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