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高效液相色谱法 高效液相色谱法 HPLC 是60年代末以经典液相色谱法为基础 引入了气相色谱的理论与实验方法 流动相用高压泵输送 采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法 与气相色谱法相比具有 适用范围广 样品预处理简单 分离效率高 流动相选择范围广 检测方法多为非破坏性的 流出组分可回收等优点 第一节概述 HPLC 液 固吸附 液 液分配 正相色谱反相色谱 一般反相色谱离子对色谱离子抑制色谱 离子交换色谱 一般离子交换色谱离子色谱氨基酸分析 空间排斥色谱 凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱 假相色谱 胶束色谱环糊精色谱 亲合色谱 手性色谱 毛细管电泳 键合相色谱 正相色谱 normalphase 流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱 常用的分析柱有 氨基柱 氰基柱 硅胶柱 常用流动相为极性小的有机溶剂 反相色谱 reversedphase 流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法 常用的分析柱有 ODS C18 C8 C2 常用流动相为甲醇 水 乙腈 水 离子抑制色谱 ionsuppressionchromatography 调节流动相的pH值 抑制组分的解离 增加组分在固定相中的溶解度 改善峰形 以达到分离有机弱酸和弱碱的目的 离子对色谱 ionpairchromatography 将反离子加入流动相中 与呈解离状态的被测物作用 生成脂溶性的中性离子对络合物 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度 改善分离效果 达到分离目的 常用反离子有 季铵盐 用于酸类烷基磺酸盐 用于碱类 离子色谱法 ionchromatography 离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术 利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离 用于亲水性阴阳离子的测定 根据是否采用抑制柱 可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱 空间排斥色谱 stericexclusion 也称凝胶色谱 依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离 类似于分子筛作用 在一定分子线团尺寸内 分子越大 保留时间越短 凝胶渗透 以有机溶剂为流动相凝胶过滤 以水溶液为流动相对于相同化学组成的高分子化合物 其分子尺寸大小与分子量成正比 因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布 胶束色谱 micellarchromatography 表面活性剂在水中超过某一浓度 临界浓度 时 多余的表面活性剂不再溶解 聚集而成胶束 胶粒 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法 它的流动相为胶束多相分散体系 不是真溶液 流动相中不含有机溶剂 因胶束色谱法的流动相是多相分散体系 在整个色谱体系中又增加了一相 故也被称为假相色谱 pseudophasechromatography 手性色谱 chiralchromatography 用于分离手性药物对映体的一种有效技术 可分为直接法和间接法两类 直接法手性固定相法 chiralstationaryphase CSP 手性流动相法 chiralmobilephaseadditive CMPA 间接法 手性试剂衍生化法chiralderivatizationreagent CDR 第二节高效液相色谱仪 高效液相色谱仪组成 输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统 液相色谱流程图 启动液相色谱仪器的流程 开启HPLC系统各个设备的电源打开泵 自动进样器 检测器电源 待设备通过自检后 打开计算机启动色谱管理软件准备流动相过滤 脱气色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵 液相柱 保留值与pH的关系 pH变化值0 1 RS变化值1 6 色谱柱 ZorbaxStableBondC184 6 250mm 5um流动相 27 甲醇 73 磷酸pH 2 5 2 6温度 50 流速 1 0mL min 2 流动相类别 按流动相组成分 单组分和多组分按极性分 极性 弱极性 非极性按使用方式分 等度洗脱和梯度洗脱 对溶剂的要求 水 去离子水自动纯水仪纯净水商品瓶装水溶剂 色谱纯 甲醇 乙腈 乙醇 丙酮 异丙醇 试剂 分析纯 不管采用何种途径 配制流动相应用新鲜水 水质要求越高放置时间越短 理想的HPLC用水应为18 2 的超纯水 并通过0 22um的滤膜 除去热源 有机物 无机离子及空气等 过滤 0 45um或更小孔径滤膜目的 除去溶剂中的微小颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是使用无机盐配制的缓冲液 脱气 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响 1 泵中气泡使液流波动 改变保留时间和峰面积2 柱中气泡使流动相绕流 峰变形3 检测器中的气泡产生基线波动 过滤与脱气 流动相的保存 有机溶剂流动相 室温下密封 避光保存缓冲盐流动相 当日现配现用 低温下密封保存 一般不超过3天防止微生物生长有机溶剂与水 缓冲盐 混配的流动相 低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器 流动相的保存 有机溶剂流动相 室温下密封 避光保存缓冲盐流动相 当日现配现用 低温下密封保存 一般不超过3天防止微生物生长有机溶剂与水 缓冲盐 混配的流动相 低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器 1 梯度洗脱的特点 1 改善分离 加快分析速度 2 改善峰形 减少拖尾 有利于痕量组分的检测 3 增加峰容量 4 强烈滞留的组分不容易残留在柱上 保持柱性能长期良好 5 下次分析时 流动相需要一段平衡时间 不同溶剂的UV吸收程度稍有差异 可能会引起基线漂移 2 梯度洗脱的主要条件 A流动相 弱溶剂组成 B流动相 强溶剂组成 梯度时间 梯度曲线 线性 凸型或凹型等 梯度 低压混合 低压梯度用单泵产生梯度 泵前 低压端 混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当 梯度的准确性受影响滞后体积 系统体积 设计合理 梯度滞后 系统体积的影响 注意 滞后体积包括进样器 阻尼器 混合器及其管路 梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如 滞后体积为2 0ml 流速1 0ml min实际梯度会比设置值晚2分钟响应 没有问题对微柱色谱影响更大 同上例但流速0 1ml min实际梯度会比设置值晚20分钟响应 不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好普通分析型液相色谱的滞后体积为2 4ml 滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统 滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果 梯度的准确性不好 造成 方法的适应性不好用静态梯度混合器 固定滞后体积可明显改善梯度特性 输液泵多用柱塞往复泵 柱塞向前运动 液体输出 流向色谱柱 向后运动 将贮液瓶中液体吸入缸体 如此往复运动 将流动相源源不断地输送到色谱柱中 柱塞往复泵属于恒流泵 流量不受柱阻影响 泵压最高为400kg cm2 这种泵具有清洗容易 更换流动相方便等优点 但脉动性较大是其缺点 目前多采用双泵补偿法来克服这一问题 避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂 例 硝酸 硫酸 盐酸 卤化物 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物 含强络合剂的溶液等 过滤 用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤 脱气 采用超声或过滤的方法 注意 流动相使用前 冲洗 使用含酸 碱 缓冲液的流动相后 必须用不含盐的有机溶剂 水冲洗 进样阀 注意 使用后应清洗 进样注意点进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置 以免虹吸作用 使样品向针筒方向回流 或从废液口流出 使用前后 要用流动相 不含酸碱等缓冲液 或甲醇或水冲洗针孔 用针孔清洗器 进样方法整个定量圈体积进样 为获得好的精密度 进样量应大于定量圈量的2 5倍以上 由于层流影响 需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相 见下图 例20 l定量圈 进样体积不能超过10 l 否则 部分样品将会从出口流失 这是因为由于层流的关系 样品流经管中心的速度是平均速度的两倍 进样前应用流动相冲洗进样孔 以除去前一针留下的样品 注射针必须清洗干净 部分定量圈体积进样 当样品量少时 采用部分体积进样 进样量由微量注射器手动控制 要求 不得超过定量圈体积的1 2量 检测器紫外检测器可变波长检测器光电二极管阵列检测器荧光检测器电化学检测器蒸发光散射示差检测器质谱 色谱图 min H A 曲线 定性 A t曲线 定量 蒸发光散射检测器 是通用检测器 适用于无紫外吸收的化合物 原理 组分先引入已通气体 N2 空气 的蒸发室 加热 使流动相蒸发而被除去 样品组分形成气溶胶而产生光散射 测定散射光强度而获得组分的浓度信号 本法中流动相在检测前已蒸发 故梯度洗脱基线稳定 组分的气溶胶 喷雾 蒸发 检测 注意 流动相必须是挥发性的 不能含缓冲盐 若调节pH可用氨水 醋酸 质谱检测器 HPLC检测器应提供的功能 对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系 并且所设计的校正技术应该促进这种关系 理想的HPLC检测器 高灵敏度 可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力 温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性 灵敏度 信噪比 灵敏度是信号与噪音的比值 即峰高与基线噪音的比值 S N 检测限 LOD S N 2 4定量限 LOQ S N 8 10好的信噪比有利于 更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度 均一性 6 1 N S 吸光度 AbsorbanceUV Vis 检测 目前实验室中最流行的选择多数公司约75 的检测器是吸光度检测器 其中50 是多波长 25 是PDA 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大 吸光度检测器 UV Vis 优点 这种检测器简单 可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以 吸光度检测器 UV Vis 缺点 由于不是所有化合物都有吸光度 因此不是通用检测器对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器样品中不同化合物的最大吸收波长不同时 需要使用多波长检测 或使用折衷的波长受流动相组成的影响 用截止波长以上至少5 10nm作为工作波长缓冲盐 离子对试剂 胺改性剂也会有影响 背景吸收对紫外检测器噪音的影响 UVSpectrumofEluentswith0 1 TFAAgainstHPLCGradeH2OBlank 溶剂混合的基线噪音 色谱条件色谱柱 C18 5 m 3 9x150mmat35 C 流动相 A 0 1 TFAinWater B 0 1 TFAinAcetonitrile 梯度 5 40 Bin35min 流速 1 0mL min 样品 水 10 Linj vol 检测 214nm 为何如此重要 五个小肽的5ng进样 好的色谱系统非常容易鉴别出所有峰 在不好的色谱系统中 第一个峰则消失在基线噪音中 基线噪音对积分的影响 色谱柱色谱柱有柱管和固定相组成 柱管用不锈钢制成 柱长10 30cm 内径2 6mm 以4 6mm的内径最常用 根据键合基团极性不同 化学键合相可分为非极性 中等极性和极性三类 常用色谱柱有 ODS柱 氰基柱 氨基柱等 非极性键合相表面基团为非极性烃基 如C18 C8等 主要用于RP色谱 C18是最常用的非极性键合相 将十八烷基氯硅烷与硅胶表面的硅醇基经多步反应而成 R1 R2 H Cl CH3 1 2 3 1 根据R1 R2基团 含碳量可分为高碳 中碳 低碳型键合相 高碳R1 R2 CH3载样量大 吸附性能大 中碳R1 H Si O Si H C18H37R2 Cl Si O低碳R1 R2 Cl 中等极性键合相 常见的有醚基键合相 这类键合相根据流动相的极性 可作为正相或反相色谱的固定相 应用较少 极性键合相 可作正相或反相色谱使用氨基键合相 硅胶 氨丙硅烷基 Si CH2 3NH2 氰基键合相 硅胶 氰乙硅烷基 Si CH2 2CN 键合相色谱pH控制在2 8 液相色谱的色谱柱 色谱柱的连接 Stop depth长度不合适造成柱前死体积 锥箍锥度不合适造成渗漏 色谱柱的连接 色谱柱使用与保存所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20 30倍的水冲洗色谱柱色谱柱柱体积冲洗体积150 4 6mm2 5ml50ml200 4 6mm3 3ml65ml250 4 6mm4 2ml80ml 保存色谱柱时用100 甲醇或乙腈 柱两端必须用接头密封 停用数天后最使用时 应先用低流速甲醇冲洗1h左右 然后再换上流动相 否则直接用流动相 柱效会下降 峰形不好 新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗 0 5ml min 色谱柱失效症状色谱柱压增高峰变宽 拖尾 裂峰塔板数下降 选择性下降 分离度降低保留值减小或增大 色谱柱失效的原因进口滤片堵塞吸附了样品杂质柱填充不良 使用久 机械及热冲击造成空洞固定相遭化学侵蚀 原因压力拖尾塔板数选择性保留值堵塞 空洞 吸附样品 化学冲击 柱凹陷 出现裂峰现象 填料与色谱柱顶端不齐平 可用相同填料填平凹陷处 压力影响 应避免突然的压力波动与任何的机械与热力冲击 如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱温等 进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动 会使色谱峰产生裂隙 柱压升高原因强保留样品组分 强吸附组分易聚集在柱进口填料上 严重缩短色谱柱寿命 尤其是生物样品提取物 含油成分等 当严重拖尾峰出现时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号 解决办法使用保护柱可延长分析柱寿命 每天实验后应用强溶剂 例甲醇 水等 至少20 30倍柱体积的量 冲洗色谱柱 并定期进行保养 以低流速的强溶剂较长时间冲洗色谱柱 样品纯度差 有微小的颗粒堵塞管路 可用滤膜过滤样品后再进样 样品浓度高 连续进样 造成过载 如果样品吸收度不是太低 使样品浓度在1mg ml以下较适宜 流动相中缓冲液浓度过高 有机相比例大 在色谱过程中堵塞管路 析出的盐结晶还磨损泵 进样阀密封圈造成漏液 缓冲液浓度一般控制在20mmol以下较适宜 测定完毕后必须及时用水充分冲洗 注意 一旦柱压升高 应停止测定 用水冲洗数小时或更长时间 待压力下降后再测定 如果不清楚堵在哪一段 则应逐级检查 换泵头上滤芯 保护柱等 柱效低的原因频繁更换流动相组成 加速柱效降低 最好一根色谱柱使用的流动相成分和pH值相近 如始终在酸性条件下或碱性条件下工作 色谱柱的选择不合适或使用时间久更换色谱柱 厂家 型号 进样操作不当转动进样阀时应一次转到位 不能过慢或停顿 否则易造成裂峰 样品溶剂与流动相成分不匹配样品溶剂与流动相成分不匹配 造成前沿峰或倒峰 如样品用纯甲醇作溶剂 而流动相中甲醇比例很低 这样易出现前沿峰 改变样品溶剂成分或比例 使醇 水比例接近于流动相 前沿峰 倒峰 结果不能重现表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积相差大 引起这种情况时 可从以下几方面来查找原因 泵 进样阀 管路漏液 造成峰面积变化 检测器灵敏度改变 如果同一样品两次进样峰面积相差10倍或更大倍数 则最可能的原因是检测器的灵敏度被无意中改变 软件的灵敏度改变不会影响峰面积的积分数值 色谱软件积分方式是否一致 尤其是对于色谱峰较复杂的 积分时基线稍有变化将造成峰面积大的变化 如果两峰不是基线分离 则峰切割方式对峰面积有很大影响 有时候采用峰高较峰面积误差小 样品溶液的稳定性有些样品在流动相条件下不稳定 放置后会产生杂质峰 应注意 例如有一样品在流动相溶液中不稳定 配制后于不同时间进样 发现在主峰后会产生一杂质峰 该杂峰随时间而迅速增大 将流动相中缓冲液换成水后 样品测定液放置15h后仍稳定 HPLC法在药物分析中的应用鉴别采用标准品对照法检查中国药典规定了5种测定方法含量测定中国药典规定了2种定量方法在进行HPLC测定时 中国药典规定要进行系统适用性试验 系统适用性试验柱效n 5 54 tR Wh 2 2分离度R 拖尾因子T 重复性取对照品或样品溶液 连续进样5次 测得峰面积相对标准差RSD应小于2 0 2 tR2 tR1 W1 W2 W0 05h 2d1 R 1 5 T 0 95 1 05 其中分离度和重复性是更具实际意义的参数 ChP 2005 定量分析方法内标法内标物要求 样品中不含有的组分 保留时间与待测物相近 但分离度R 1 5 理化性质相近 有足够的纯度 外标法 标准对照法C样 A样 A标 C标 日常维护和常见色谱故障 溶剂及样品的准备 过滤溶剂的目的湿防止固体颗粒损伤仪器或柱头 未经过滤的溶剂或者溶剂瓶中生长微生物 都会降低溶剂入口过滤头的寿命 并影响泵的性能 一般要求两天过滤一次 注意 过滤水相或有机相应该选用不同的滤膜 聚四氟乙烯几乎可以过滤所有的溶剂 酸和碱 尼龙66可以和大多数的有机物 水相容 但是建议不要用于强酸 二氯甲烷和DMF 纤维素滤膜用于水相 83 溶剂脱气的方法 氦气脱气 真空脱气 回流加热脱气 超身脱气 最为常用 避免使用的溶剂 卤化物碱金属溶液及相应的酸溶液 高浓度的无机酸如硝酸 硫酸 能形成自由基的试剂及其混合物 四氯化碳和异丙醇或THF混合液 含强络合剂的溶液 84 色谱柱的平衡 为了确保分析结果的再现性 对于反相柱应使用5 10倍柱体积的流动相平衡色谱柱 注意 新装到系统的色谱柱需要进行初始化 先断开柱子和检测器间的管路 用流动相将色谱柱中的原有流动相或气泡移出色谱柱 然后再将色谱柱和检测器间的管路接好 85 保护色谱柱 过滤所有的溶剂和样品使用保护柱仪器使用完毕 要冲洗整个系统 移走系统中缓冲液柱子不使用时 两端密封注意柱子使用的pH范围不要高压冲洗柱子 不要高温下过长时间的使用硅胶键合相 86 常见色谱故障 基线噪音 可能的原因 检测池脏 检测器灯能量下降 由泵引起的脉冲 检测器上的温度效应 检测池中有气泡通过 87 常见色谱故障 基线漂移 可能原因 梯度洗脱引起 流动相脏 柱子没平衡 系统中污染物溢出RID检测器温度不稳定 88 常见色谱故障 鬼峰 鬼峰 没有进样就有色谱峰出现原因 流动相脏 尤其是水相 89 常见色谱故障 双峰 柱头塌陷或柱床运动泵头过滤芯部分堵塞组分共流出 常见色谱故障 压力过高 可能原因 柱子进口过滤芯被污染Purge阀过滤芯被污染色谱柱被污染连接管路堵塞进样器旋转密封阀被堵塞进样针或者针座被堵塞可用分段法来检查哪一段发生堵塞 90 常见色谱故障 压力过低 溶剂进口过滤芯被堵连接管路泄漏或其他备件泄漏溶剂或流速的改变主动阀失灵四元比例阀失灵单向出口阀失灵柱子失效 固定相流失 91 常见色谱故障 压力波动